基于發(fā)光細(xì)菌的2 種便攜式生物毒性檢測儀器的性能測試

張琳琳，劉 剛,2，方 俊

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所， 湖南 長沙 410125）

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，水體中毒性物質(zhì)的豐度和廣度不斷增加，因此對水體質(zhì)量的監(jiān)測成為社會各界廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。發(fā)光細(xì)菌法的生物急性毒性檢測是以發(fā)光細(xì)菌為生物受試體，與樣品接觸反應(yīng)一定時間后，通過生物毒性傳感器來讀取樣品發(fā)光強(qiáng)度變化與無毒性空白對照比值的一種快速、重復(fù)性高、誤差小的生物急性檢測方法[2]，已在多個國家的毒性檢測領(lǐng)域應(yīng)用[3]。由于其獨(dú)特的生理特性，發(fā)光細(xì)菌在快速檢測水體毒理成分時具備檢測周期短、靈敏度高、檢測方式便捷、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)[4]。 對于發(fā)光細(xì)菌種類的選擇，國內(nèi)常用的有明亮發(fā)光桿菌、青海弧菌和費(fèi)氏弧菌，美國環(huán)保署推薦的是費(fèi)氏弧菌[5-6]。這類細(xì)菌在正常生理環(huán)境下的新陳代謝會產(chǎn)生熒光物質(zhì)，而當(dāng)水體中有毒物質(zhì)含量升高時，發(fā)光細(xì)菌的呼吸作用就會受到抑制，因此所產(chǎn)生的熒光信號強(qiáng)度會變?nèi)酢ａ槍@一特性，便攜發(fā)光細(xì)菌毒性儀只需要檢測熒光信號的強(qiáng)弱，就可以對水體毒性做出判斷[7-9]。該研究采用同時滿足國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的費(fèi)氏弧菌對市面上最常用的2 種便攜式生物毒性檢測儀器進(jìn)行性能測試，以期為毒理檢測的儀器選擇提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

從長沙縣松雅湖采集湖庫水，從撈刀河鎮(zhèn)茶子山村采集地下井水和養(yǎng)殖污水，從長沙恒昌化工廠采集化工廢水。不同水樣均于2020 年1 月5 日現(xiàn)場采集，用pH 試紙測量水樣pH 值，確保其在6.0～8.5 范圍內(nèi)，若不在該范圍內(nèi)，用稀鹽酸溶液或稀氫氧化鈉溶液中和水樣pH 值至7.0±0.2。

1.2 供試設(shè)備與試劑

供試生物毒性測定儀分2 種型號，一種為國產(chǎn)Lux-T020 型，一種為美國DeltaTox Ⅱ型；其他設(shè)備還有2 mL 玻璃檢測池、美國熱電移液器（200 μL、1 mL）。主要試劑有費(fèi)氏弧菌凍干粉（實(shí)驗(yàn)室自產(chǎn)），氯化鈉、七水硫酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉（國藥分析純）和純凈水。

1.3 測試方法與步驟

采用GB/T15441—1995[10]中的方法進(jìn)行分析測定。（1）打開測試儀器，預(yù)熱10 min，在黑暗條件下，測試36 次未加樣品的本底讀值，檢測儀器背景信號的穩(wěn)定性。（2）取2 mL 含3%氯化鈉的參比水，分別加入20～280 μL（以20 μL 為一個等級，共設(shè)計14個梯度）的費(fèi)氏弧菌菌懸液，2 臺儀器同時檢測，比較光電倍增管的曲線變化。（3）取2 mL 含3%氯化鈉的樣品，加入25 μL 費(fèi)氏弧菌菌懸液（取1 支在-20℃保存的費(fèi)氏弧菌凍干粉，加入40 mL 復(fù)蘇液水合溶解，置于4℃冰箱中，供待測樣品使用），菌液與樣品的接觸反應(yīng)時間為15 min。水樣、陰性質(zhì)控（純凈水）和陽性質(zhì)控（2 mg/L 的七水硫酸鋅）均平行測定6 次，以相對抑制率來表示毒性大小。

相對抑制率（%）=1-相對發(fā)光強(qiáng)度（%）

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器的穩(wěn)定性

從表1 可以看出，國產(chǎn)Lux-T020 型儀器的暗計數(shù)讀值在25～84 S-1之間波動，滿足出廠≤200 S-1的要求；而美國DeltaTox Ⅱ型儀器的暗計數(shù)讀值在4～12 S-1之間波動，滿足出廠≤100 S-1的要求。

2.2 2 種生物毒性測定儀光電倍增管的變化曲線

從圖1 可以看出，美國DeltaTox Ⅱ型儀器在491043 3～358262 96 S-1之間有較好的線性，國產(chǎn)Lux-T020 型儀器在266 768 4～195 675 43 S-1之間有較好的線性，2 臺儀器所用檢測器（光電倍增管）的線性范圍存在著明顯的差異。從圖1 中還可以看出，美國DeltaTox Ⅱ型儀器在第8 個點(diǎn)（即添加160 μL 費(fèi)氏弧菌菌懸液）時，光子量已達(dá)到飽和，國產(chǎn)Lux-T020 型儀器的光子量在第10 個點(diǎn)（即添加200 μL 費(fèi)氏弧菌菌懸液）時達(dá)到飽和。

表1 2 臺儀器的暗計數(shù)讀值 （S-1）

圖1 2 種生物毒性測定儀光電倍增管的變化曲線

2.3 陰性、陽性質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，采用純凈水做參比時，2 臺儀器測試得到的相對抑制率在-2.46%～2.94%范圍內(nèi)，均滿足儀器設(shè)計參數(shù)±5%的要求；當(dāng)以2 mg/L 七水硫酸鋅作陽性質(zhì)控液、以純凈水做參比時，國產(chǎn)Lux-T020型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.00，美國DeltaTox Ⅱ型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67，但美國DeltaTox Ⅱ型儀器獲得的相對抑制率比國產(chǎn)Lux-T020 型儀器獲得的平均偏高20.28 個百分點(diǎn)。

2.4 4 種水樣測試結(jié)果

由表3 可知，測試清潔的湖庫水，國產(chǎn)Lux-T020型儀器的測試極差為14.3，美國DeltaTox Ⅱ型儀器的測試極差為12.6；測試未受污染的地下井水，國產(chǎn)Lux-T020 型儀器的測試極差為11.5，DeltaTox Ⅱ型儀器的測試極差為4.7；測試養(yǎng)殖污水，國產(chǎn)Lux-T020型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差1.13，美國DeltaTox Ⅱ型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.59；測試有毒化工廢水，國產(chǎn)Lux-T020型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.30，美國DeltaTox Ⅱ型儀器的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03。

表3 不同水樣的測試結(jié)果 （%）

中國科學(xué)院南京土壤研究所將水質(zhì)毒性分為5 個等級。由表4 可知，2 臺儀器在測試清潔的湖庫水與地下井水時，毒性級別均為低毒；但測試養(yǎng)殖污水時，國產(chǎn)Lux-T020 型儀器的毒性級別為中毒，而美國DeltaTox Ⅱ型儀器的毒性級別為重毒；2 臺儀器在測試化工廢水時，毒性級別均為高毒。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用費(fèi)氏弧菌凍干粉，在相同的測試條件下，儀器的暗計數(shù)、陰性質(zhì)控均能達(dá)到指標(biāo)要求。測試較清潔的湖庫水和地下井水時，2 臺儀器的毒性分級同在低毒級別。通過光電倍增管的線性范圍比較得知，2 臺儀器所選光電倍增管的型號不同，是造成測試養(yǎng)殖污水時，水樣毒性分級不一致的主要原因。水樣測試的相對抑制率越高，水樣的毒性越強(qiáng)。目前國內(nèi)環(huán)境監(jiān)測部門使用的便攜式毒性儀有各種品牌，各品牌的生物毒性檢測模式、所用菌種、光電倍增管各有差異，均會造成測試現(xiàn)場水樣的數(shù)值和毒性分級不一致。