lncRNA HOXA11-AS抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡與基質(zhì)降解的作用研究

錢亮，李宏軍，施源，鄧新超

(武漢市第八醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430010)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，其主要特征是關(guān)節(jié)軟骨退化、軟骨細(xì)胞減少、軟骨下硬化重塑和滑膜炎[1]，會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和僵硬，嚴(yán)重時(shí)引起關(guān)節(jié)畸形甚至身體殘疾。每年全球有數(shù)百萬人受到OA的影響，據(jù)估計(jì)到2020年OA將成為第四大最致殘的疾病[2]。OA的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)因素，其中肥胖、機(jī)械壓力、性別和衰老是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。目前，控制關(guān)節(jié)炎引起的疼痛和癥狀是兩個(gè)主要的治療目標(biāo)。而軟骨細(xì)胞主要負(fù)責(zé)軟骨的合成-分解代謝平衡，在關(guān)節(jié)軟骨的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[3]。越來越多的證據(jù)表明，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與軟骨細(xì)胞死亡、凋亡或程序性細(xì)胞死亡有關(guān)[4-7]。據(jù)報(bào)道，軟骨細(xì)胞凋亡在OA的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解中也起著關(guān)鍵作用[6，8]。

長鏈非編碼RNA(long-nocoding RNA，lncRNA)是一類長度200 nt的非編碼RNA，有研究表明，許多l(xiāng)ncRNA在不同組織中以及在各種發(fā)育和病理?xiàng)l件下差異表達(dá)，并在腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為如增殖、凋亡、遷移和侵襲中具有重要調(diào)控作用[9-11]。lncRNA HOXA11-AS是最近發(fā)現(xiàn)的lncRNA分子，在胃癌、宮頸癌、卵巢癌等中均發(fā)揮著重要的功能[12-15]，但其在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織和細(xì)胞中的研究尚未見報(bào)道。本研究通過檢測lncRNA HOXA11-AS在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，來探究其對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡、基質(zhì)降解以及相關(guān)通路的影響，以闡明lncRNA HOXA11-AS在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中的作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與材料 主要試劑：弗氏完全佐劑、青霉素鈉/慶大霉素、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)/特性F12培養(yǎng)基(ham's F12 nutrient medium，F(xiàn)12)購于美國Sigma公司；Lipofectamine2000、Annexin V-FITC試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；RNAiso Plus試劑盒和All-in-OneTMcDNA第一鏈合成試劑盒購于美國GeneCopoeia公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購于日本Takara公司；抗Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metallo protein-13，MMP-13)、血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5(a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type 5 motifs，ADAMTS-5)、抗肌動(dòng)蛋白(β-non-muscle，β-actin)、抗核因子κB抑制蛋白(anti-nuclear factor kappa B inhibitory protein，IκBα)、抗磷酸化核因子κB抑制蛋白(anti-phosphorylated nuclear factor kappa B inhibitory protein，p-IκBα)、抗核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)購于美國Abcam 公司。其他試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

材料：清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(100±10)g購于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 方 法

1.2.1 OA模型建立 將44只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成兩組：正常組與模型組，每組22只。參照Panicker法[16]制作大鼠的OA模型：大鼠進(jìn)行備皮與75%酒精消毒后，將100μL弗氏完全佐劑注射到右前側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)，分別于第1、3、7天注射1次，每日強(qiáng)制大鼠進(jìn)行活動(dòng)60 min。7 d后如果觀察到大鼠右前側(cè)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛，同時(shí)伴有軟組織腫脹，出現(xiàn)積液以及右前側(cè)膝關(guān)節(jié)僵硬與活動(dòng)程度受限等現(xiàn)象，說明模型制作成功。正常組大鼠右后肢內(nèi)膝骨關(guān)節(jié)周圍組織中與造模大鼠同步注射等容積0.9%氯化鈉注射液。造模成功后處死兩組大鼠，解剖得到關(guān)節(jié)軟骨組織。

1.2.2 軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將切下的軟骨組織剪碎，用含1%青霉素鈉/慶大霉素雙抗液的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗，用0.25%胰蛋白酶充分消化，37℃震蕩孵育40 min，離心棄上清液，加入0.2% Ⅱ型膠原酶在37℃下震蕩孵育6 h，200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，離心棄上清液，得到原代軟骨細(xì)胞，將其置于含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞。取第3代的軟骨細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將軟骨細(xì)胞按照每孔5×104個(gè)的密度接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別在兩個(gè)無酶離心管中加4 μg HOXA11-AS小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)(或4 μg陰性對(duì)照，NC siRNA)+250 μL opti minimal essential medium(OPTI-MEM)、5 μL Lipofectamine 2000+250 μL OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基，室溫孵育5 min，將稀釋后的siRNA和Lipofectamine 2000充分混勻，室溫靜置20 min。將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗滌，添加新鮮培養(yǎng)基，每孔加入上述混合物培養(yǎng)6 h后，棄去上清，PBS清洗后加新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8檢測 將轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞以1×104個(gè)/孔均勻鋪于96孔板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。分別于0、6、12、24、48、96 h時(shí)，每孔加10 μL CCK-8溶液，再將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標(biāo)儀上450 nm處檢測各組吸光光度值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集懸浮細(xì)胞，離心棄去培養(yǎng)基，用不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰蛋白酶消化，預(yù)冷的PBS洗滌兩次，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，在細(xì)胞懸浮液加入5 μL Annexin V-FITC，接著加入10 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，室溫避光孵育20 min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)用CELL QUEST軟件分析處理。

1.2.6 ELISA檢測 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集并離心，得到細(xì)胞上清液。加入上清液于96孔板，在37℃下孵育2 h，PBS去除板內(nèi)液體，洗滌后用濾紙印干；每孔加入抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl 2-associated X protein，Bax)、抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、抗半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)一抗工作液(稀釋為1︰1 000)，37℃孵育1 h，去除板內(nèi)液體，再次洗滌并用濾紙印干；每孔加入辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白抗體(immunoglobulin G，IgG抗體)(1︰5 000)，置37℃孵育1 h，洗板后印干；每孔加入底物工作液，置37℃暗處反應(yīng)10 min，加入終止液，酶標(biāo)儀檢測490 nm處光密度值(optical density，OD)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 用RNAiso Plus提取轉(zhuǎn)染48 h后的軟骨細(xì)胞總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，根據(jù)Gene Copoeia逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)，以cDNA為模版，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒檢測基因表達(dá)，以GAPDH作為為內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：上游引物1μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL、無酶水8.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-△△Ct法計(jì)算各檢測目的基因的相對(duì)表達(dá)量，使用的引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法 使用RIPA裂解緩沖液(radio immuno precipitation assay lysis buffer，RIPA lysis buffer)提取轉(zhuǎn)染48 h后軟骨細(xì)胞總蛋白，用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣品上樣到10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，切膠并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入抗Collagen-Ⅱ、抗aggrecan、 抗MMP-13、抗ADAMTS-5、抗β-actin、抗IκBα、抗p-IκBα、抗NF-κB p65 4℃過夜。洗膜，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG抗體(1∶5000)，室溫孵育2 h；洗膜后，采用ECL化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence，ECL)顯影，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質(zhì)灰度值。

1.2.9 細(xì)胞免疫熒光染色 將轉(zhuǎn)染48 h后軟骨細(xì)胞用PBS清洗后，加4%多聚甲醛中固定15 min，在含有0.5%TritonX-100的PBS中通透15 min，PBS清洗。在室溫下用10%山羊血清封閉細(xì)胞2 h，隨后加入NF-κB一抗(1︰200)，4 ℃孵育過夜。第2天用PBS洗滌后，滴加FITC標(biāo)記的熒光二抗(1︰250)室溫避光孵育1 h，然后加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避光孵育5 min，PBS清洗3次后使用熒光顯微鏡捕獲圖像。

2 結(jié) 果

2.1 HOXA11-AS在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況 使用qRT-PCR檢測HOXA11-AS在OA大鼠的表達(dá)是否發(fā)生變化。通過檢測OA大鼠和正常組大鼠的軟骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠軟骨細(xì)胞相比，OA大鼠軟骨細(xì)胞中HOXA11-AS的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01，見圖1)。

注：*與正常組相比，P<0.01

2.2 HOXA11-AS對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 為進(jìn)一步揭示HOXA11-AS對(duì)OA軟骨細(xì)胞的影響，使用siRNA技術(shù)來沉默HOXA11-AS在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)。經(jīng)過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組(NC siRNA)對(duì)比，轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA 48 h后，軟骨細(xì)胞中HOXA11-AS的表達(dá)呈顯著下降(見圖2a，P<0.01)。通過CCK-8檢測不同轉(zhuǎn)染時(shí)間(0、6、12、24、48、96 h)軟骨細(xì)胞的活力，與NC siRNA組相比，軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA后，在轉(zhuǎn)染12、24、48、96 h后細(xì)胞的活性顯著下降(見圖2b，P<0.01)，結(jié)果表明HOXA11-AS能提高軟骨細(xì)胞活性。

a qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞中HOXA11-AS的表達(dá)水平 b CCK-8檢測不同轉(zhuǎn)染時(shí)間軟骨細(xì)胞的活力

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染siRNA后軟骨細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：與NC siRNA相比，轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA的軟骨細(xì)胞，其凋亡率明顯提高(P<0.01)，說明HOXA11-AS能夠抑制軟骨細(xì)胞的凋亡(見圖3)。

注：*與正常組相比，P<0.01

通過ELISA檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中大鼠軟骨細(xì)胞凋亡標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，與NC siRNA相比，轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siR-NA的軟骨細(xì)胞Bax、Caspase-3的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)量顯著低于NC siRNA組(P<0.05，見表2)。

表2 兩組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡標(biāo)志物表達(dá)量比較

2.3 HOXA11-AS對(duì)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解的影響 接著我們研究了HOXA11-AS對(duì)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解的影響，與NC siRNA相比，轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA的軟骨細(xì)胞中MMP-13、ADAMTS-5 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，而Collagen Ⅱ、aggrecan的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.01，見圖4)，這一結(jié)果表明HOXA11-AS能抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。

2.4 HOXA11-AS對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響 與NC siRNA組比較，轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA組的軟骨細(xì)胞中IκBα蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，p-IκBα和NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01，見圖5a)。與此結(jié)果一致，通過細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS siRNA組中NF-κB p65在軟骨細(xì)胞核中的表達(dá)水平較高(見圖5b)。由此說明沉默HOXA11-AS的表達(dá)后激活了NF-κB信號(hào)通路，可見HOXA11-AS可抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。

a Western blot檢測轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞中基質(zhì)降解相關(guān)基因蛋白表達(dá)情況

b Western blot檢測轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞中基質(zhì)降解相關(guān)基因蛋白表達(dá)情況

a qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞中基質(zhì)降解相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況

b 免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞核中NF-κB p65的表達(dá)情況(免疫熒光檢測，400 μm)

3 討 論

軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中存在的唯一一種細(xì)胞類型，它能夠調(diào)節(jié)軟骨基質(zhì)合成與分解之間的平衡。當(dāng)關(guān)節(jié)受到過度的機(jī)械壓力或炎癥刺激時(shí)，軟骨細(xì)胞會(huì)就發(fā)生變性和凋亡，從而導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的合成與分解失衡，誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的不可逆病理過程[17]。越來越多的證據(jù)表明，軟骨細(xì)胞的凋亡極大地促進(jìn)了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展[18-20]。

通過近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與了多種生物學(xué)過程，如控制細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞分化和維持胚胎干細(xì)胞多能性等[21]。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明，多種lncRNA與OA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。例如，Steck等[22]證明lncRNA H19是軟骨細(xì)胞中合成代謝的標(biāo)志物；Su等[10]發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比，OA軟骨樣品中的lncRNA MEG3表達(dá)明顯下調(diào)，并可能通過調(diào)節(jié)血管生成來促進(jìn)OA的發(fā)展進(jìn)程；Song等[11]的研究表明，與正常軟骨細(xì)胞相比，在OA患者的軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了lncRNA GAS5高表達(dá)，而GAS5的過表達(dá)還誘導(dǎo)了一些MMPs家族成員的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallo protein-2，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metallo protein-3，MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallo protein-9，MMP-9)和MMP-13。由此說明，lncRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中起到一定的作用，有希望作為OA治療的靶標(biāo)。然而，關(guān)于HOXA11-AS在骨關(guān)節(jié)炎中的研究至今卻未見報(bào)道。通過本研究，我們建立了骨關(guān)節(jié)炎的大鼠模型，并檢測了HOXA11-AS在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，HOXA11-AS在OA大鼠的軟骨細(xì)胞中高表達(dá)。

為了進(jìn)一步確認(rèn)HOXA11-AS在OA中的功能作用，通過siRNA技術(shù)抑制了HOXA11-AS的表達(dá)，在不同時(shí)間段測定軟骨細(xì)胞的存活率后發(fā)現(xiàn)，從轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA 12 h后開始，細(xì)胞活力顯著下降。同樣，在轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA的軟骨細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率高于轉(zhuǎn)染NC siRNA對(duì)照組，相關(guān)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的表達(dá)也發(fā)生了變化，促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達(dá)量顯著上升，而抑凋亡因子Bcl-2的表達(dá)量顯著下降，這些結(jié)果均從側(cè)面反映了HOXA11-AS能夠抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。

而在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中，細(xì)胞外基質(zhì)降解起著至關(guān)重要的作用，降低軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解水平可以抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[23]。aggrecan和Collagen Ⅱ是細(xì)胞基質(zhì)的重要成分，MMP和ADAMTS的過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而加速軟骨組織的破壞[24]，當(dāng)MMP-13和ADAMTS-5過度表達(dá)時(shí)，促進(jìn)Collagen Ⅱ和aggrecan的分解。通過研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA組的軟骨細(xì)胞中，MMP-13、ADAMTS-5基因和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，同時(shí)，Collagen Ⅱ和aggrecan的基因和蛋白表達(dá)水平明顯下降[25]。由此說明，HOXA11-AS可以抑制軟骨細(xì)胞中MMP-13和ADAMTS-5的過表達(dá)以及Collagen Ⅱ和aggrecan表達(dá)下降，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解。

NF-κB通路作為調(diào)控炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路，被激活后會(huì)引起一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)軟骨組織退化[26]。通過本研究檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HOXA11-AS siRNA組軟骨細(xì)胞中IκBα蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)p-IκBα和NF-κB p65均明顯升高，進(jìn)而通過細(xì)胞免疫熒光檢測得到NF-κB p65在HOXA11-AS siRNA組軟骨細(xì)胞核中的表達(dá)水平較高。IκBα是NF-κB活化的抑制劑，但其活化后能顯著促進(jìn)NF-κB活化，NF-κB轉(zhuǎn)移入核并表達(dá)為NF-κB p65[27]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HOXA11-AS可抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。

通過本研究我們首次明確了lncRNA HOXA11-AS在OA軟骨細(xì)胞中高表達(dá)，HOXA11-AS的表達(dá)會(huì)抑制軟骨細(xì)胞凋亡、基質(zhì)降解和抑制NF-κB通路的激活，由此說明HOXA11-AS在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中起著重要的作用，可作為骨關(guān)節(jié)炎預(yù)防與治療的靶點(diǎn)。