基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探索荊芥-防風(fēng)藥對(duì)治療冠狀病毒肺炎的潛在機(jī)制

黃少杰，牟 菲，李 飛，陳海霞,2，王文軍,2，馬 陽(yáng),2，王婧雯*，丁 一*

1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安 710032；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽(yáng) 712000

2019年12月，武漢爆發(fā)了由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎。患者以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，重癥患者多在發(fā)病一周后出現(xiàn)呼吸困難和/或低氧血癥，嚴(yán)重者快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血障礙等[1]。截止2020年5月26日24時(shí)，我國(guó)已累計(jì)報(bào)告確診病例82 993例，現(xiàn)有確診病例79例(其中重癥病例5例)，累計(jì)治愈出院病例78 280例，累計(jì)死亡病例4 634例[2]，同時(shí)海外感染發(fā)病持續(xù)上升，現(xiàn)累計(jì)確診病例已超過(guò)550萬(wàn)例。這是21世紀(jì)短短20年間冠狀病毒在2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、2015年中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)之后第三次大規(guī)模流行。冠狀病毒每次大規(guī)模流行都嚴(yán)重威脅人類健康，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和沉重負(fù)擔(dān)。然而，臨床對(duì)治療冠狀病毒引起的肺炎尚無(wú)特效藥，多采用支持治療為主[3]，因此相關(guān)藥物研究迫在眉睫。

自新型冠狀病毒疫情發(fā)生以來(lái)，根據(jù)各省市自治區(qū)相關(guān)診療方案和建議[4]，中醫(yī)藥已經(jīng)廣泛應(yīng)用于新型冠狀病毒的治療，其中多省市推薦中藥中用到了荊芥、防風(fēng)。荊芥(Schizonepetae Herba，SH)為唇形科植物荊芥(NepetacatariaL.)的干燥地上部分。其味辛，性微溫，具有解表散風(fēng)，透疹，消瘡之功效[5]。防風(fēng)(Saposhnikoviae Radix，SR)為傘形科植物防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.)Schischk.)的干燥根，味辛、甘，性微溫。具有祛風(fēng)解表，勝濕止痛，止痙之功效[6]。荊芥和防風(fēng)是《宣明論方》所記載的防風(fēng)通圣丸的君藥，二者作為散風(fēng)寒、祛風(fēng)勝濕的藥對(duì)收載于《施今墨藥對(duì)》。荊芥和防風(fēng)均具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗炎、止血等作用[7,8]。

自2008年提出以來(lái)[9]，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門從系統(tǒng)層面揭示中藥對(duì)機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用的新興學(xué)科，由于其整體性、系統(tǒng)性的研究方法和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥學(xué)多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)相吻合，已經(jīng)成為系統(tǒng)性分析中藥復(fù)方多靶點(diǎn)，多通路作用機(jī)制的有效工具。多項(xiàng)研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索中藥作用機(jī)制已經(jīng)取得成功[10]。綜上，本文擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探究荊芥-防風(fēng)藥對(duì)治療冠狀病毒肺炎的潛在機(jī)制，為荊芥-防風(fēng)的臨床應(yīng)用提供參考。

1 方法

1.1 荊芥-防風(fēng)成分篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在TCMSP[11](http://tcmspw.com/tcmsp.php)、ETCM[12](http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html)和BATMAN-TCM[13](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫(kù)分別以“荊芥”、“防風(fēng)”、“JingJie”、“FangFeng”為關(guān)鍵詞，收集荊芥-防風(fēng)中化學(xué)成分，并以生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為吸收、分布、代謝、排泄(absorption,distribution,metabolism and excretion，ADME)參數(shù)篩選出活性成分，并在數(shù)據(jù)庫(kù)中收集活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)將收集到的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為Uniprot Entry格式，并通過(guò)Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，分析荊芥-防風(fēng)治療冠狀病毒肺炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.2 冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)收集

應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org/)，NCBI Gene數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)輸入關(guān)鍵詞“coronavirus pneumonia”收集冠狀病毒肺炎相關(guān)靶點(diǎn)。并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)名稱統(tǒng)一校正為Uniprot Entry格式。將活性成分作用靶點(diǎn)與冠狀病毒肺炎相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到荊芥-防風(fēng)藥對(duì)治療冠狀病毒肺炎關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫(kù)STRING(https://string-db.org/)，選擇“Homo sapiens”，設(shè)定置信度≥0.700，分析關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用，并將收集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，篩選收集度值(degree)高于平均值的重要靶點(diǎn)。

1.4 GO功能富集和KEGG通路富集

為探索關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物功能和作用通路，將關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[14](https://david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。并以P<0.05為條件進(jìn)行篩選，選取基因數(shù)目排名前20的通路，利用ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)工具在線繪制氣泡圖。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，探究成分-靶點(diǎn)-通路之間的關(guān)系。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分mol2格式化學(xué)結(jié)構(gòu)，檢索RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)獲得蛋白晶體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Pymol軟件進(jìn)行去水、加氫等操作后保存為PDB格式，應(yīng)用Autodock[15]軟件對(duì)“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的度值大于平均值的化學(xué)成分和PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要蛋白及SARS病毒受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(angiotensin converting enzyme II，ACE2)、COVID-19 main protease(RDS ID：6LU7)進(jìn)行分子對(duì)接。通過(guò)binding energy的值評(píng)價(jià)活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的對(duì)接效果。

2 結(jié)果

2.1 荊芥-防風(fēng)活性成分篩選及“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)檢索TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到荊芥化學(xué)成分159種，防風(fēng)中化學(xué)成分173種；在ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到荊芥化學(xué)成分32種，防風(fēng)化學(xué)成分32種；在BATMAN-TCM中檢索到荊芥化學(xué)成分67種，防風(fēng)化學(xué)成分71種。通過(guò)設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，防風(fēng)中篩選出活性成分20種，荊芥中活性成分11種，其中兩者共有活性成分3種(表1)，并獲得活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn)402個(gè)。通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)(圖1)。通過(guò)分析網(wǎng)絡(luò)性質(zhì)，活性成分M01(luteolin)、M03(quercetin)、M04(wogonin)、M05(beta-sitosterol)、M07(stigmasterol)、M08(clionasterol)、M11(hesperetin)、M24(5-O-methylvisamminol)、M25(schizonepetoside B)的度值(degree)高于平均值，說(shuō)明這些成分可能是荊芥-防風(fēng)抗冠狀病毒肺炎的關(guān)鍵成分。

表1 荊芥-防風(fēng)中活性化合物的基本信息

圖1 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 藥物靶點(diǎn)基因篩選及關(guān)鍵基因獲取

通過(guò)檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI Gene數(shù)據(jù)庫(kù)刪除重復(fù)項(xiàng)后得獲冠狀病毒肺炎相關(guān)靶點(diǎn)252個(gè)，與活性成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集后共獲得56個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)(圖2)。

圖2 活性成分靶點(diǎn)(A)和冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)(B)Venn圖

2.3 PPI網(wǎng)路構(gòu)建與分析

將56個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，基因類型改為“Homo sapiens”，并將置信度設(shè)置為high confidence 0.700，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖TSV格式文件，將其導(dǎo)入Cytoscaope軟件進(jìn)行可視化處理(圖3)。圖3中共涉及54個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)，399條邊(edge)。PPI網(wǎng)路圖中，節(jié)點(diǎn)根據(jù)度值從最低點(diǎn)以順時(shí)針排列為圓形，節(jié)點(diǎn)的大小代表betweenness centrality大小，節(jié)點(diǎn)顏色從淡綠色漸變至橙色表示closeness centrality從小到大變化，edge的粗細(xì)從粗到細(xì)表示edge betweenness從大到小，利用edge顏色從淡綠色漸變至橙色表示combined score大小。共有23個(gè)蛋白度值高于平均值(表2)，其中度值前十的蛋白為IL6、TNF、MAPK1、TP53、IL1β、RELA、IL10、CXCL8、CCL2、ICAM1，說(shuō)明這10種蛋白在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白相互作用較多，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要作用。

圖3 56個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 Degree值高于平均值的23個(gè)靶蛋白

2.4 GO功能富集和KEGG靶點(diǎn)通路富集分析

經(jīng)過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析，以P<0.05為條件共收集到176個(gè)生物過(guò)程(biological process)，47個(gè)分子功能(cell compound)，36個(gè)細(xì)胞組分(molecular function)和99條KEGG通路(圖4)，所包含基因數(shù)最多的前20的通路詳細(xì)信息結(jié)果見(jiàn)表3。將DANID分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖5。GO功能富集表明，荊芥-防風(fēng)藥對(duì)可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)(inflammatory response)生物過(guò)程發(fā)揮作用，同時(shí)還作用于正調(diào)控RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、免疫應(yīng)答(immune response)、負(fù)調(diào)控凋亡過(guò)程(negative regulation of apoptotic process)、凋亡過(guò)程(apoptotic process)等生物過(guò)程。KEGG通路分析表明荊芥-防風(fēng)藥對(duì)可能通過(guò)TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)等信號(hào)通路發(fā)揮抗冠狀病毒肺炎的作用。“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果顯示，luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol四種化合物在網(wǎng)絡(luò)圖中度值高于平均度值，提示這些化合物可能在荊芥-防風(fēng)藥理作用的發(fā)揮中扮演重要角色。

圖4 GO功能富集和KEGG通路富集

表3 基因數(shù)目前20的KEGG通路基本信息

圖5 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)路圖

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

利用Autodock軟件，選取“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中度值高于平均值的四個(gè)化合物(luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol)與PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前五的靶點(diǎn)(IL6、TNF、MAPK1、IL1β、TP53)及ACE2、COVID-19 main protease進(jìn)行對(duì)接，除M01、M03、M04與TP53對(duì)接后binding energy大于-5 kcal/mol外，其余結(jié)果均小于-5 kcal/mol，說(shuō)明活性成分和靶蛋白能形成穩(wěn)定的結(jié)合，如表4所示。利用Pymol軟件對(duì)活性化合物與ACE2、COVID-19 main protease結(jié)果進(jìn)行可視化處理結(jié)果如圖5所示A、B、C、D分別為luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol與ACE2蛋白對(duì)接模式圖，E、F、G、H分別為luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol與COVID-19 main protease蛋白對(duì)接模式圖。

表4 活性成分與潛在靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果

圖6 活性成分與ACE2、COVID-19 main protease的分子對(duì)接模式

3 討論

荊芥和防風(fēng)為常見(jiàn)疏風(fēng)解表、清熱退熱類中藥，具有抗炎、抗菌、抗病毒、解熱等藥理作用[16]。自新型冠狀病毒疫情發(fā)生以來(lái)，荊芥和防風(fēng)被廣泛的應(yīng)用于冠狀病毒肺炎的治療，有較為滿意的臨床療效，提高了臨床治愈率[17]，然而其作用機(jī)制并不明確，同時(shí)缺乏分子水平實(shí)驗(yàn)研究。因此，深入研究分析荊芥-防風(fēng)治療冠狀病毒肺炎作用機(jī)制，探索其潛在作用靶點(diǎn)，為荊芥-防風(fēng)后續(xù)分子機(jī)制研究提供了方向，同時(shí)對(duì)臨床應(yīng)用具有重要意義。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究了荊芥-防風(fēng)治療冠狀病毒肺炎的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)和作用通路。發(fā)現(xiàn)荊芥-防風(fēng)藥對(duì)可能通過(guò)luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol等活性產(chǎn)物，作用于IL6、TNF、MAPK1、IL1β、TP53等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、正調(diào)控RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、免疫應(yīng)答、負(fù)調(diào)控凋亡過(guò)程等生物過(guò)程，通過(guò)TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等發(fā)揮多成分、多靶點(diǎn)、多通路抗冠狀病毒肺炎的藥理作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)圖參數(shù)顯示，IL6、TNF、MAPK1、TP53、IL1β、RELA、IL10等23種蛋白度值高于平均值，說(shuō)明其在PPI網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白聯(lián)系緊密、相互作用較強(qiáng)。其中，IL6、IL1β、TNF、IL10等炎性因子相關(guān)蛋白均具有較高的度值，處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置，這些靶點(diǎn)蛋白均參與呼吸道疾病的免疫應(yīng)答和炎癥過(guò)程，與炎癥反應(yīng)對(duì)呼吸道的刺激密切相關(guān)。一項(xiàng)最新的關(guān)于冠狀病毒肺炎患者遺體解剖研究顯示[18]，死者肺部損傷明顯，炎性病變清晰，說(shuō)明炎癥反應(yīng)在冠狀病毒肺炎的病情發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，荊芥-防風(fēng)可能通過(guò)這些靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎作用。Kindrachuk等[19]研究表明，靶向MAPK信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路的抑制劑無(wú)論是在病毒感染之前還是之后，都抑制冠狀病毒的復(fù)制，KEGG富集結(jié)果同樣顯示，MAPK信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路富集結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HIF-1信號(hào)通路同樣在維持肺泡上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[20]，與KEGG通路富集結(jié)果一致。說(shuō)明荊芥-防風(fēng)藥對(duì)中活性物質(zhì)可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路發(fā)揮抗冠狀病毒肺炎藥理作用。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選，我們發(fā)現(xiàn)luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol化合物在“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值高于平均值。因此，我們將這四種成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前五的分子進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果顯示這四種成分與IL6、TNF、MAPK1、IL1β對(duì)接能量均小于-5 kcal/mol，beta-sitosterol與TP53對(duì)接結(jié)果小于-0.5 kcal/mol。說(shuō)明荊芥-防風(fēng)的活性化學(xué)成分可以和IL6、IL1β、TNF和TP53蛋白較穩(wěn)定的結(jié)合。同時(shí)，已研究表明[21-24]，luteolin、quercetin、wogonin、beta-sitosterol均表現(xiàn)出較好的抗炎活性，表明這些成分在荊芥-防風(fēng)藥對(duì)抗炎作用中扮演了重要角色。由于冠狀病毒肺炎為新發(fā)疾病，疾病靶點(diǎn)收錄并不完整，我們將度值大于平均值的化學(xué)成分與SARS病毒ACE2和COVID-19 main protease進(jìn)行了對(duì)接驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)四種化學(xué)與ACE2、COVID-19 main protease均取得較好對(duì)接結(jié)果。說(shuō)明荊芥-防風(fēng)活性物質(zhì)可能于這兩種蛋白結(jié)合發(fā)揮抗冠狀病毒肺炎的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法對(duì)荊芥-防風(fēng)藥對(duì)治療冠狀病毒肺炎的藥效物質(zhì)和作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)篩選出的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)接了活性物質(zhì)與SARS病毒受體ACE2和COVID-19 main protease，發(fā)現(xiàn)了荊芥-防風(fēng)潛在的抗冠狀病毒可能性，為荊芥-防風(fēng)臨床應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供了支撐，也為課題組后續(xù)荊芥-防風(fēng)活性物質(zhì)篩選及作用靶點(diǎn)研究打下了基礎(chǔ)。