三種七葉一枝花活性成分抗新型冠狀病毒的分子對(duì)接預(yù)測(cè)

司 淵，王 糾，張 亮，劉雪文，劉 瑩,,4*

1湖北醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2湖北醫(yī)藥學(xué)院 胚胎干細(xì)胞湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3湖北醫(yī)藥學(xué)院 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4湖北醫(yī)藥學(xué)院 生物醫(yī)藥研究院，十堰 442000

2019年12月，新型冠狀病毒SARS-CoV-2在湖北省武漢市迅速爆發(fā)[1]。截至2020年6月22日，我國(guó)共有85 018例新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)確診病例，其中死亡患者4 646例。其后，美國(guó)、意大利、西班牙、英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、伊朗、瑞士、韓國(guó)、日本等全球200多個(gè)國(guó)家也報(bào)道了超過(guò)897萬(wàn)例感染病例。感染SARS-CoV-2的患者的常見(jiàn)癥狀是發(fā)燒，咳嗽和肌痛或疲勞[2,3]。SARS-CoV-2的S蛋白和SARS-CoV的S蛋白結(jié)構(gòu)相似，并且均對(duì)人細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)具有顯著的結(jié)合親和力，通過(guò)ACE2的介導(dǎo)進(jìn)入人體。ACE2在肺，消化道，腎臟等組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，目前認(rèn)為是SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵[4,5]。臨床治療表明，傳統(tǒng)中藥結(jié)合西藥對(duì)COVID-19具有顯著的治療效果[6]。到目前為止，對(duì)COVID-19的治療還缺乏特效藥。因此，迫切需要找到有效的抗病毒藥物來(lái)遏制這種疾病。

百合科重樓屬植物七葉一枝花(Parispolyphylla)又名蚤休、草河車、白甘遂，其根莖稱為重樓。重樓作為中草藥藥用歷史悠久[7,8]，有抗炎、止血、殺菌、鎮(zhèn)靜、止痛、平喘、止咳的作用，民間還用于治療各種瘡毒、癰疽、毒蛇咬傷等[9,10]。20世紀(jì)70年代以來(lái)，關(guān)于重樓中的活性成分的研究一直在繼續(xù)。目前，已在重樓中發(fā)現(xiàn)了上百種化學(xué)成分，其中有70多種為甾體皂苷類化合物。而重樓中含量較多的甾體皂苷類化合物異包括螺甾烷醇類的薯蕷皂苷和偏諾皂苷。重樓皂苷I(polyphyllin I)、重樓皂苷VI(polyphyllin VI)和重樓皂苷VII(polyphyllin VII)均屬于薯蕷皂苷(圖1)，在重樓中含量豐富，廣泛用于多種疾病治療研究，包括抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)，抑菌作用等。重樓皂苷為螺旋甾烷類皂苷；皂苷由苷元與糖、糖醛酸或其他有機(jī)酸組成。其結(jié)構(gòu)上包含一個(gè)共有的母核(圖1)，母核由六個(gè)環(huán)，27個(gè)碳原子組成，其中A、B、C、D為甾體母核(環(huán)戊烷多氫菲)。甾體母核連接一個(gè)呋喃環(huán)E和一個(gè)吡喃環(huán)F。并多以螺縮酮形式相連。

圖1 重樓中三種活性成分及其母核結(jié)構(gòu)式

有研究報(bào)道重樓對(duì)亞洲A型流感病毒有抑制作用[11]。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)研究仍主要集中于其抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用[12]，較少見(jiàn)其抗病毒方面的作用。為了研究重樓是否具有抗SARS-CoV-2的潛在作用，我們對(duì)3種主要重樓皂苷進(jìn)行分子對(duì)接模擬，預(yù)測(cè)其結(jié)合ACE2的能力。通過(guò)結(jié)合自由能評(píng)估3種化合物與ACE2之間的相互作用，為COVID-19的藥物發(fā)現(xiàn)提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

三種化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)中PDB的編號(hào)為6ACG。

1.2 方法

分子對(duì)接：所有的對(duì)接實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Autodock 4.2程序。在AutoDock 4.2計(jì)算程序中，采用0.375間隔的70×70×70點(diǎn)陣模塊。使用Lamarckian遺傳算法進(jìn)行對(duì)接計(jì)算，算法如下：150的群體，最大值2 500萬(wàn)次能源評(píng)估，最高次數(shù)2 000，交叉率0.8，突變率0.02，獨(dú)立對(duì)接運(yùn)行50次。使用公差為2的均方根偏差將對(duì)接構(gòu)象聚類，并根據(jù)結(jié)合自由能評(píng)估最終對(duì)接結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷I與SARS-CoV-2受體ACE2存在結(jié)合作用

分子對(duì)接結(jié)果表明，重樓皂苷I可能與ACE2酶具有最高的結(jié)合活性，結(jié)合自由能為-9.01 kcal/mol，潛在的結(jié)合位點(diǎn)包括Phe-40、Arg-273、Phe-274、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Phe-390、Arg-393、Asn-394、His-401、Glu-402、Glu-406、Tyr-515、Arg-518等氨基酸殘基。重樓皂苷I的氫原子能夠與Glu-406上的氧原子形成氫鍵，氫鍵鍵長(zhǎng)為2.2?(圖2)。

圖2 重樓皂苷I結(jié)合SARS-CoV-2受體ACE2的分子對(duì)接結(jié)果

2.2 重樓皂苷VI與SARS-CoV-2受體ACE2存在結(jié)合作用

重樓皂苷VI結(jié)合ACE2的自由能是-8.52 kcal/mol，潛在的結(jié)合位點(diǎn)包括Leu-73、Ala-99、Gln-102、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Glu-375、His-378、Asp-382、Tyr-385、Asn-394、Gly-395、Asn-397、Glu-398、His-401、Glu-402、Arg-514等氨基酸殘基。重樓皂苷VI的氫原子能夠與Tyr-385氨基酸上的氧原子形成氫鍵，氫鍵鍵長(zhǎng)為2.1?和2.2?；配體上的氫原子與Glu-402上的氧原子形成氫鍵，鍵長(zhǎng)為2.0?(圖3)。

圖3 重樓皂苷VI結(jié)合SARS-CoV-2受體ACE2的分子對(duì)接結(jié)果

2.3 重樓皂苷VII與SARS-CoV-2受體ACE2存在結(jié)合作用

重樓皂苷VII結(jié)合ACE2的自由能是-8.21 kcal/mol，潛在的結(jié)合位點(diǎn)包括Phe-40、Ser-44、Trp-69、Leu-73、Pro-346、Thr-347、Ala-348、Trp-349、Asp-350、Glu-375、His-378、Phe-390、Asn-394、His-401、Glu-402、Glu-406、Tyr-515等氨基酸殘基。重樓皂苷VII的氫原子能夠與Ser-44上的氧原子形成氫鍵，氫鍵鍵長(zhǎng)為2.0?(圖4)。

圖4 重樓皂苷VII結(jié)合SARS-CoV-2受體ACE2的分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

以上對(duì)接結(jié)果表明，3個(gè)甾體皂苷和ACE2均存在較強(qiáng)的結(jié)合作用，而其中重樓皂苷 I和ACE2結(jié)合所需的能量最低。能量越低表明更易于結(jié)合ACE2。通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)匯總分析，三種化合物共同結(jié)合ACE2蛋白的殘基有7個(gè)，分別是Pro-346、Thr-347、Ala-348、Asp-350、Asn-394、His-401、和Glu-402(圖5)。同時(shí)，從圖中可以看出重樓皂苷I和重樓皂苷VI結(jié)合活性位點(diǎn)取向相同，但是由于空間位阻原因，重樓皂苷VI無(wú)法像重樓皂苷I呈直線排布。重樓皂苷I和重樓皂苷VII的空間位阻類似，但是取向相反。三種藥物結(jié)合活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)主要是母核起著關(guān)鍵作用，與其相作用的氨基酸位點(diǎn)大部分以疏水作用氨基酸(His、Ala、Pro)為主，其次是起到氫鍵作用的氨基酸。含有羥基的氨基酸(Glu、Thr、Asp等)可以更好的容納糖環(huán)。

圖5 三種重樓皂苷結(jié)合SARS-CoV-2受體ACE2的分子對(duì)接總圖及共同結(jié)合的氨基酸殘基位點(diǎn)

由于SARS-CoV-2是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，目前還沒(méi)有確定或可用的特效藥物。而經(jīng)濟(jì)有效的治療策略是利用現(xiàn)有藥物。臨床治療表明，中藥結(jié)合西藥對(duì)COVID-19具有顯著的治療效果[6]。因而篩選從中草藥中提取的現(xiàn)有藥物不失是一項(xiàng)有效策略。已有研究發(fā)現(xiàn)氯喹(chloroquine)在體外控制SARS-CoV-2感染方面非常有效。氯喹是一種4-氨基喹啉，除了主要作為抗瘧藥物，還能夠通過(guò)減少ACE2受體的末端糖基化，干擾SARS-CoV-2與ACE2受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用[13]。Cheng等[14]使用分子對(duì)接來(lái)計(jì)算氯喹與ACE2結(jié)合能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯喹具有與ACE2的潛在結(jié)合能力，結(jié)合自由能為-5.70 kcal/mol，結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)eu-95、Gln-58、Gln-102。與氯喹相比，三種重樓皂苷與ACE2的對(duì)接結(jié)合自由能更低。近期，隨著SARS-CoV-2感染的全球化擴(kuò)散，越來(lái)越多的研究者投入到抗SARS-CoV-2藥物的篩選中。Yan等[15]通過(guò)分子對(duì)接對(duì)38種中國(guó)專利藥物進(jìn)行針對(duì)ACE(PDB:1R4L)及病毒主要M蛋白酶(PDB: 6LU7)的對(duì)接篩選，發(fā)現(xiàn)了包括青蒿素、蘆丁、甘草甜素、葛根素、穿心蓮內(nèi)酯、苦參堿等10種潛在抗SARS-CoV-2藥物。Liu等[16]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)木犀草素(-26.78 kJ/mol)、槲皮素(-26.36 kJ/mol)、去甲脫水淫羊藿黃素(-25.94 kJ/mol)與SARS-CoV-2 3CL水解酶存在結(jié)合作用。可能有些藥物與ACE2對(duì)接活性較低，但這并不意味著它們不適用COVID-19治療，因?yàn)閷?duì)接模擬僅是提供一個(gè)前期研究的參考。此外，制定中藥處方的原則包括消除病原入侵和增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。因此，我們不能排除有些藥物通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對(duì)COVID-19起作用。有必要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證這些甾體皂苷類化合物是否可以靶向ACE2并預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中SARS-CoV-2的感染。