霍山石斛和鐵皮石斛干花成分含量和抗氧化性的比較

張珍林，閔運江，黃仁術，劉莉彬，陳乃富*

1皖西學院生物與制藥工程學院；2植物細胞工程安徽省工程技術研究中心；3安徽省中藥資源保護與持續利用工程實驗室，六安 237012

石斛是一種多年生草本中藥，其中安徽霍山是蘭科植物石斛屬產地之一，位于大別山區北方[1]。安徽霍山產石斛種類雖多，但主要以霍山石斛和鐵皮石斛兩種為主產，每年4～5月份或10月份是霍山石斛的花期，5～7月份或10～11月份是鐵皮石斛的花期，兩種石斛花期均較短暫。

目前研究并開發石斛的藥、食、賞價值已經很成熟，但花作為石斛的一大亮點，在研究、開發利用上并沒有得到很好的發展。近幾年關于石斛花的文獻報道，總結有以下幾個方面，研究石斛花的物質成分及抗氧化性，如：Miao等[2]關于超聲-醋酸法提取鐵皮石斛花總黃酮及其體外抗氧化性的研究報道；Zhang[3]、Liang[4]等關于石斛花多糖、黃酮以及藥理學研究報道；研究加工條件對石斛花品質的影響，如：Zhang等[5]關于石斛花鼓風干燥機理和感官品質變化規律的研究報道；研究石斛花的揮發性成分，如：Lyu等[6]對11個鐵皮石斛雜交系鮮花的揮發性成分分析，Qu等[7]關于四種石斛花氨基酸和揮發性成分比較研究。可見，對石斛花的基礎研究存在一些，但并不全面，而從上述文獻了解，石斛花是具備成為新型食品功能因子來源的潛力，伴隨著人們對抗氧化性物質與健康的關系認識的發展，對石斛花進行深加工產品的研究值得關注。

所以，結合前期對石斛干花干制條件的摸索和研究[5]，依托霍山石斛花干制技術規程的制定，本研究進行了霍山產兩種主要石斛花的營養成分、活性成分以及抗氧化性的分析比較。本試驗以霍山主產的霍山石斛干花和鐵皮石斛干花為原料，根據測定營養成分(蛋白質、氨基酸、維生素C、脂肪、總酸、多糖)、次生代謝物(多酚、黃酮、單寧)、兩種石斛干花醇提液的抗氧化性進行分析研究。為充實石斛干花的深加工產品，建立完善石斛干花營養品質評價體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料

實驗材料為2018年5月初開始，分批次采自安徽省霍山縣國家基本藥物所霍山石斛原種基地，鮮花均來自根系生長3年的石斛，霍山石斛鮮花5月初(每日清晨)采收，鐵皮石斛鮮花6月初(每日清晨)采收，去雜，攤晾，遠紅外鼓風干制，-20 ℃保藏，每次按統計學概率取樣。經筆者陳乃富教授鑒定分別為霍山石斛DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng、鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的花。

1.1.2 儀器

數控超聲波清洗器(KQ300DE型昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平((FA1204B上海越平科技有限公司)；高速萬能粉碎機(FW100型津市泰斯特儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(UV2100型尤尼柯上海儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(天津市紐森科技有限公司)；氨基酸自動分析儀(L8900型日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 石斛干花營養成分分析方法

蛋白質含量測定，采用凱氏定氮法；維生素C含量測定，采用2,6～二氯靛酚滴定法；總酸含量測定，采用pH電位法；粗脂肪含量測定，采用索氏抽提法；粗多糖含量測定，采用硫酸-苯酚法。

1.2.2 石斛干花活性成分分析方法

總多酚含量測定，采用酒石酸亞鐵比色法。

單寧含量測定，參照Zhao等[8]的方法并稍作修改；分別準確稱取5.000 g干花粉，用80 mL水洗入100 mL容量瓶中，放入沸水浴中提取30 min，取出、冷卻、定容，吸取2.0 mL樣品提取液，離心4 min(8 000 rpm)，上清液備用。

總黃酮含量測定，參照Chang等[9]的方法并稍作修改；分別準確稱取5.000 g石斛干花粉末于濾紙包中放入蒸餾瓶中，加入相應濃度的乙醇溶液，開始熱回流提取，平行提取三次，將每次的收集液置于250 mL容量瓶中，最后用乙醇溶液定容至刻度，離心取上層清液備用。

1.2.3 石斛干花氨基酸含量測定與評價

氨基酸含量測定，參照Liu等[10]的方法并稍作修改；分別準確稱取5.000 g兩種石斛干花粉，加入5 mL 4%磺基水楊酸超聲30 min，離心30 min(12 000 rpm)，取上清液備用；聯合L8900日立氨基酸自動分析儀對試樣中的17種氨基酸成分進行分析測定。

根據測定的氨基酸含量進行該樣品的評價分析，參照Wei等[11]的計算方法；根據測定的氨基酸含量分別進行氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)、必須氨基酸指數(EAAI)分析。

1.2.4 石斛干花抗氧化性測定方法

DPPH自由基清除能力測定參照Sarker等[12]的方法并稍作修改。分別準確稱取5.000 g已過260目篩的兩種石斛干花粉置于裝有40 mL濃度70%的乙醇溶液的圓底燒瓶中，熱回流提取2 h，提取3次，每次所得提取液于250 mL容量瓶中，再用70%乙醇定容至刻度線，搖勻備用，以無水乙醇為空白，于517 nm處測定吸光度，同時以VC標準品作為對照，隨后進行DPPH自由基清除能力的測試。清除率計算公式：清除率=[1-(A2-A1)/A0]×100%。

式中：A0：DPPH溶液和乙醇的吸光值；A1：乙醇與各濃度待測液的吸光值；A2：DPPH與各濃度待測液的吸光值。

鐵氰化鉀還原力測定參照Choochote等[13]的方法并稍作修改，獲取提取液方法同上，,以水為空白，VC為陽性對照，于700 nm測定吸光度，隨后進行鐵氰化鉀還原力測試。

1.2.5 數據分析

所有數據均采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，所有實驗均重復測定3次；通過單因素方差分析(one-way ANOVA)對平均值、標準差及化學組分和抗氧化性間的相關性進行顯著性比較，P<0.05表明具有差異，處理結果有顯著差異出現，組間的平均值顯著性再進行Duncan多重比較；每組數據均使用平均數±相對平均標準差表示。

2 結果與分析

2.1 石斛干花營養成分含量和活性成分含量

安徽霍山產霍山石斛干花和鐵皮石斛干花的營養成分含量和活性成分含量結果見表1。通過表1可得到，霍山石斛干花的維生素C、粗多糖、粗蛋白、單寧、總酸的含量均高于鐵皮石斛干花，而粗脂肪含量略低于鐵皮石斛干花。從營養性角度來看，霍山石斛干花比鐵皮石斛干花更適合作為人補充維生素C和蛋白質的良好來源。從功能性角度來看，霍山石斛干花在多酚、黃酮、單寧含量上均高于鐵皮石斛干花，且霍山石斛干花中單寧的含量比鐵皮石斛干花高33.6%，預測霍山石斛干花的抗氧化功效高于鐵皮石斛干花。霍山石斛干花除粗脂肪和粗多糖含量與鐵皮石斛干花無差異(P>0.05)，其余成分兩種石斛干花均是差異顯著(P<0.05)。

2.2 石斛干花氨基酸組成成分分析

2.2.1 石斛干花氨基酸組成成分

霍山產兩種石斛干花的氨基酸測定結果統計見表2，兩種石斛干花中常見氨基酸種類全面，均檢測出17種氨基酸，兩者氨基酸含量相比，霍山石斛干花略高于鐵皮石斛干花，其中，兩種花中酪氨酸含量都為最高。根據FAO/WHO的理想模式，質量較好的蛋白質其 EAA/TAA為0.40左右，EAA/NEAA在0.60以上，由此可見，霍山石斛干花比鐵皮石斛干花更符合FAO/WHO的理想模式，表明其氨基酸營養價值高于鐵皮石斛干花。

表2 石斛干花的氨基酸含量

2.2.2 石斛干花氨基酸組成成分分析

根據表2霍山石斛干花和鐵皮石斛干花氨基酸含量結果，知道霍山產兩種石斛干花均含有人體必需氨基酸，依據WHO提議的必需氨基酸成人攝取模式與雞蛋氨基酸攝食模式，計算兩種石斛干花的AAS、CS、EAAI值，進一步分析兩種石斛干花營養品質，計算所得數據統計于表3。統計兩石斛干花必需氨基酸含量評分總數分別為171.42 mg/g N、192.75 mg/g N，由此得出，兩種石斛干花必需氨基酸評分總量均大于FAO/WHO標準的35 mg/g N和雞蛋蛋白質標準的49.7 mg/g N。兩石斛干花的氨基酸評分(AAS)和化學評分(CS)比值均大于100，這表明石斛干花中必需氨基酸模式極佳，人體在攝食時消化吸收和利用沒有障礙。兩種石斛干花中的EAAI值均在100以上，均是大于FAO/WHO評分模式中同種氨基酸含量。

表3 石斛干花的AAS、CS、EAAI比較

2.3 石斛干花抗氧化活性

2.3.1 石斛干花提取液對DPPH自由基清除能力

兩種石斛干花提取液和對照品Vc對DPPH自由基清除能力如圖1所示，由圖可知，霍山石斛干花和鐵皮石斛干花提取液均具有對DPPH自由基清除能力，且清除效果和溶液濃度相關。在0.1～1.0 mg/mL之間隨著濃度的增加，對DPPH自由基清除能力逐漸增強。其中，計算得出霍山石斛干花提取物抗氧化的半數抑制濃度(IC50)為0.528 mg/mL，鐵皮石斛干花提取物抗氧化的半數抑制濃度(IC50)為0.604 mg/mL。

圖1 不同種類的石斛干花提取液自由基清除率效果

2.3.2 石斛干花提取液對鐵氰化鉀還原能力

通過鐵氰化鉀法測定兩種石斛干花提取液和對照品Vc的還原能力，測得數據結果如圖2。據圖2看出，霍山石斛干花和鐵皮石斛干花均具有對鐵氰化鉀的還原能力，且還原能力和濃度相關，在0.04～0.24 mg/mL的質量濃度之間對鐵氰化鉀還原力亦是隨濃度的增加而加大，且霍山石斛干花和鐵皮石斛干花都表現出還原力線性關系良好，霍山石斛干花提取液對鐵氰化鉀的還原力高于鐵皮石斛干花，但還原力均比對照品Vc弱。

圖2 不同品種的石斛干花提取液還原能力效果

2.4 石斛干花成分含量與抗氧化能力的相關性分析

2.4.1 霍山石斛干花成分含量與抗氧化能力的相關性分析

對霍山石斛干花所有測定成分和抗氧化性的相關性分析見表4。查相關系數臨界值表，當α=0.05時，r=0.606；當α=0.01時，r=0.776得出，單寧與粗多糖正相關，多酚與粗多糖、單寧正相關，黃酮與粗蛋白、維生素C、單寧、多酚正相關，DPPH自由基清除率IC50與粗多糖、單寧、多酚、黃酮、氨基酸正相關，鐵氰化鉀還原能力與粗多糖、單寧、多酚、黃酮正相關。

表4 霍山石斛干花成分相關性分析

2.4.2 鐵皮石斛干花成分含量與抗氧化能力的相關性分析

對鐵皮石斛干花所有測定成分的相關性分析見表5。查相關系數臨界值表，同上得出，單寧與粗多糖正相關，多酚與粗蛋白、粗多糖、單寧正相關，黃酮與維生素C、單寧、多酚正相關，氨基酸與單寧正相關，DPPH自由基清除率IC50與粗多糖、單寧、多酚、黃酮正相關，鐵氰化鉀還原能力與粗多糖、單寧、多酚、黃酮正相關。

表5 鐵皮石斛干花成分相關性分析

3 討論

前人的研究發現，涉及石斛及石斛花的研究主要集中在單一石斛品種，如Xin等[14]對鐵皮石斛不同花期及花朵不同部位活性組分分析，只探討了不同花期鐵皮石斛花及盛花期花朵不同部位多糖、總黃酮及總酚質量分數的差異；多個石斛品種單一物質或多個石斛品種僅幾個部分物質成分方面，如Zhang等[15]對石斛樣品中幾種營養成分的分析研究，也只是對粗灰分、全氮、全磷、鈣和鎂等5種營養成分分析。有關安徽霍山產石斛花整體物質成分的研究鮮有報道，本次研究對霍山石斛干花和鐵皮石斛干花的粗蛋白、粗脂肪、粗多糖、維生素C、總酸、單寧、多酚、黃酮含量進行測定，發現霍山石斛干花中的粗蛋白、維生素C、單寧、總酸、多酚、黃酮與鐵皮石斛干花相比明顯高，且霍山石斛干花中必需氨基酸含量高于鐵皮石斛干花，這一研究結果是首次提出。

前人的研究發現，果蔬、花卉等由于多酚氧化酶的存會導致在加工過程中產品顏色變深，如Jiu等[16]研究熱激結合水楊酸處理對蝴蝶蘭組培褐變的影響，發現多酚氧化酶對蝴蝶蘭組培褐變影響很大。也有前人研究烏雞的黑色素存在和酪氨酸有很大關系，如Li等[17]對日糧酪氨酸水平對0～4周齡泰和烏骨雞生產性能及組織黑色素含量的影響研究。還有前人研究發現酪氨酸酶的存在是生物體中唯一參與黑色素合成的關鍵酶，Yan等[18]從美花石斛的莖中分離得到了12個化合物，其中有3個表現出良好的護膚活性，表達出酪氨酸酶抑制劑在美花石斛提取物中可以抑制酪氨酸酶活性。本研究在氨基酸測定時發現在兩種干花中酪氨酸含量都為最高，酪氨酸是一種多酚衍生物，可以被酪氨酸單酚酶催化，由此推斷石斛花干制后顏色會變深跟酪氨酸含量高有很大關系，對加工干制石斛花時進行顏色品質控制提供理論依據。

前人的研究結果表明，石斛花的抗氧化能力與總黃酮/蘆丁的含量、多糖含量成正相關[2-4]。本研究在進行石斛干花成分含量與抗氧化能力的相關性分析時得出，霍山石斛干花和鐵皮石斛干花在顯著水平為0.05%時，抗氧化性能與多酚含量、黃酮含量、多糖含量、單寧含量、氨基酸含量均成正相關。前人在紫薯的研究中發現，不能單獨利用花青素質量分數解釋抗氧化能力的強弱，而是由多種生物活性物質綜合決定[19]。本研究發現兩種石斛干花主要營養成分之間多是相互獨立的，在含量上沒有表現出顯著的相關性，說明它們之間不存在潛在的關聯機制；但兩種石斛干花主要次生代謝產物之間表現出極大正相關性，單寧含量、多酚含量、黃酮含量與主要營養成分之間都有一定關系，且單寧含量、多酚含量、黃酮含量相互也均呈現正相關，表明在植物生長過程中主要營養成分對次生產物含量是有影響，因此全面準確地分析霍山石斛干花和鐵皮石斛干花提取液的抗氧化性對指導產品開發利用具有重要價值。

4 結論

霍山產霍山石斛干花和鐵皮石斛干花均具有均衡的營養成分和活性成分，但霍山石斛干花中的粗蛋白、維生素C、單寧、總酸、多酚、黃酮含量明顯較高，且霍山石斛干花中必需氨基酸含量高于鐵皮石斛干花，對DPPH自由基清除效果及鐵氰化鉀的還原能力也是霍山石斛干花表現出強抗氧化能力。鑒于霍山石斛干花具有豐富的營養成分、活性成分及較強的抗氧化活性，可以作為石斛花新品和天然抗氧化劑資源進行開發利用，成為補充人體所需營養來源的一種理想原料。