白及須根多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化、酪氨酸酶抑制活性研究

陳向陽，宋 武，檀小菲，王婷婷，耿玉闖，王衛(wèi)東，康清俊，吳永祥*

1黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，黃山 245041；2黃山峰源生物科技有限公司，黃山 245600；3黃山荷琇生物科技有限公司，黃山 245000

白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.P.E是蘭科(Orchidaceae)白及屬植物，為傳統(tǒng)珍貴中藥材，主產(chǎn)于云南、貴州、安徽、四川、湖北、河南、浙江等地。白及藥用歷史悠久，具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤和創(chuàng)傷治愈等作用，可用于治療咯血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥狀[1-3]。本課題組前期研究表明[4,5]，白及塊莖的不同極性萃取物具有顯著的抗氧化、抑菌和α-淀粉酶抑制作用，采用GC-MS進(jìn)行化學(xué)成分分析，揭示白及發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是其多酚類物質(zhì)。白及的塊莖是作為傳統(tǒng)的藥用部位，在實際的采挖過程中，白及的須根被刨除而棄之不用，然而白及須根與塊莖的比例高達(dá)1∶4～1∶3，資源被大量浪費[6]。據(jù)統(tǒng)計，2017年全國白及種植面積為2 600 km2，白及總產(chǎn)量約3 500 t，白及須根副產(chǎn)物高達(dá)了1 000 t[7]。研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，白及塊莖及其須根富含結(jié)構(gòu)相同或相似的化學(xué)物質(zhì)，其中有些活性成分如多酚、多糖等在須根中的含量遠(yuǎn)高于塊莖，甚至某些聯(lián)菲類成分僅存在于須根中，具有優(yōu)于塊莖的抑菌、抗菌、抗腫瘤等藥理作用。

酪氨酸酶(tyrosinase)是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含二價銅離子的金屬酶，廣泛存在動植物、微生物以及人體，與果蔬酶促褐變和人體皮膚黑色素的形成密切相關(guān)[11]。酪氨酸酶抑制劑能夠用于化妝品、醫(yī)藥和食品工業(yè)等領(lǐng)域。甘油具有低毒性、低成本和無需去除溶劑等優(yōu)點，相比于甲醇、丙酮和乙醇等有機(jī)提取溶劑，被視為綠色溶劑，已被應(yīng)用于植物中木質(zhì)素、黃酮類和多酚類化合物的提取[12]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對白及須根的研究都是基于化學(xué)成分鑒定及功效評價，對白及須根多酚提取工藝優(yōu)化的研究仍然缺乏，白及須根多酚的抗氧化、酪氨酸酶抑制作用研究尚未見報道。為合理開發(fā)與利用白及須根資源，本研究采用甘油為提取溶劑，聯(lián)合高剪切分散乳化技術(shù)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計方法對 BRP 提取量的二次回歸模型進(jìn)行分析，采用響應(yīng)面設(shè)計實驗對BRP提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定BRP的最佳的提取條件，并探討B(tài)RP的體外抗氧化、酪氨酸酶抑制效果。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

白及須根，由黃山峰源生物科技有限公司提供，2018年5月于安徽省祁門縣采集；甘油(豐益油脂化學(xué)(上海)有限公司)；酪氨酸酶(tyrosinase，50 000 units)、左旋多巴、丹寧酸(tannic acid，TA)、維生素C(Vc)(Sigma-Aldrich公司)；福林酚試劑、DPPH、ABTS(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2 儀器

FE28-standard型精密pH計(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)；AR124CN型電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；A25型高剪切分散乳化機(jī)(上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司)；SpectraMax-190型全波長酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；EV341型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 高剪切分散乳化技術(shù)輔助甘油提取白及須根多酚

將白及須根洗凈、晾干，置于55 ℃烘箱中干燥至恒重，用高速粉碎機(jī)進(jìn)行破碎，過80目篩，得到白及須根粉末。取白及須根粉末0.5 g，按照料液比1∶40 g/mL加入用蒸餾水稀釋成體積分?jǐn)?shù)為40%的甘油，用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為5、溫度為50 ℃，以16 200 rpm的轉(zhuǎn)速剪切，時間設(shè)定為150 s進(jìn)行提取，過濾后即得白及須根多酚提取液。

2.2 多酚含量測定

參考文獻(xiàn)[4]，采用Folin-Ciocalteu 法測定白及須根中的多酚含量。以吸光值Y為縱坐標(biāo)，TA濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=0.001 3X+0.011(R2=0.993 1)。根據(jù)下列公式計算白及須根中的多酚含量：

(1)

式中，c：表示不同提取條件下待測液中多酚濃度，mg/mL；N：表示提取液到待測液的稀釋倍數(shù)；V：表示提取液的體積，mL；m：表示白及須根的質(zhì)量，為0.5 g。

2.3 單因素實驗

2.3.1 甘油濃度對 BRP 提取量的影響

固定料液比為1∶40(g/mL)、pH為5、剪切時間為150 s、剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm、剪切溫度為50 ℃，考察不同甘油體積分?jǐn)?shù)(0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)對BRP提取量的影響。

2.3.2 pH 對 BRP 提取量的影響

固定甘油濃度為40%、料液比為1∶40(g/mL)、剪切時間為150 s、剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm、剪切溫度為50 ℃，考察不同pH值(3、4、5、6、7)對BRP提取量的影響。

2.3.3 剪切轉(zhuǎn)速對 BRP 提取量的影響

固定甘油濃度為40%、料液比為1∶40(g/mL)、pH為5、剪切時間為150 s、剪切溫度為50 ℃，考察不同剪切轉(zhuǎn)速(10 600、13 400、16 200、19 000、21 800 rpm)對BRP提取量的影響。

2.3.4 剪切時間對 BRP 提取量的影響

固定甘油濃度為40%、料液比為1∶40(g/mL)、pH為5、剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm、剪切溫度為50 ℃，考察不同剪切時間(90、120、150、180、210 s)對BRP提取量的影響。

2.3.5 剪切溫度對 BRP 提取量的影響

固定甘油濃度為40%、料液比為1∶40(g/mL)、pH為5、剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm、剪切時間為150 s，考察不同剪切溫度(30、40、50、60、70 ℃)對BRP提取量的影響。

2.3.6 料液比對 BRP 提取量的影響

固定甘油濃度為40%、pH為5、剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm、剪切時間為150 s、剪切溫度為50 ℃，考察不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)對BRP提取量的影響。

2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù) Box-Behnken實驗設(shè)計原理，以甘油濃度(A)、pH(B)、剪切轉(zhuǎn)速(C)、剪切溫度(D)四個顯著影響因素作為變量，采用四因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計，從而對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。實驗設(shè)計與因素水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計

2.5 抗氧化活性的評價

ABTS自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[13]；DPPH自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[14]；還原能力的測定參考文獻(xiàn)[13]。以VC為陽性對照。

2.6 酪氨酸酶抑制作用的測定

根據(jù)Lee等[15]的測定方法稍加改進(jìn)，具體如下：向96孔板中依次加入50 μL 70 mM磷酸緩沖液(pH=6.8)、80 μL 10 mM的左旋多巴與50 μL不同濃度的 BRP(0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL)，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)5 min。然后加入20 μL 125 unit/mL的酪氨酸酶溶液，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，在酶標(biāo)儀中于475 nm波長處測定樣品組吸光度值。以Vc水溶液為陽性對照，并按照下列公式計算酪氨酸酶抑制率：

(2)

式中，I：表示酪氨酸酶抑制率；AS：表示樣品組吸光度值；ASB：表示樣品對照組吸光值；AC：表示空白組吸光值；ACB：表示空白對照組吸光值。

2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。采用Duncan’s多重比較法分析結(jié)果的差異顯著性(P<0.05)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗結(jié)果

3.1.1 甘油濃度對BRP提取量的影響

由圖1所示，BRP 提取量隨著甘油濃度的增加呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)甘油濃度達(dá)到50%時，BRP 提取量達(dá)到最大，為15.85±0.42 mg/g，與未添加甘油組(10.15±0.17 mg/g)相比，多酚提取量增加了56.19%，存在著顯著性差異(P<0.05)。這是因為甘油溶液的極性隨甘油濃度的變化而變化，導(dǎo)致酚類化合物的溶解度不同，使得多酚提取量發(fā)生變化[12]。當(dāng)甘油濃度過高時可能由于粘度過大影響多酚的提取，從而導(dǎo)致多酚提取量的降低。因此，選取甘油濃度40%～60%作為響應(yīng)面實驗參考因素。

圖1 甘油濃度對BRP提取量的影響

3.1.2 pH對BRP提取量的影響

由圖2所示，pH值在3～4范圍時，BRP 提取量與pH呈現(xiàn)出正相關(guān)，當(dāng)pH為4時，BRP 提取量達(dá)到最大值，為16.18±0.14 mg/g，存在著顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)pH值大于4時，BRP 提取量與pH呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。這可能由于白及須根多酚富含酚羥基，在較低酸性條件下，多酚性質(zhì)較為穩(wěn)定；當(dāng)pH過大時，破壞了多酚的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致多酚提取量的降低[16]。因此，選用pH值3～5作為響應(yīng)面參考因素。

圖2 pH對BRP提取量的影響

3.1.3 剪切轉(zhuǎn)速對BRP提取量的影響

由圖3所示，當(dāng)剪切轉(zhuǎn)速在10 600～16 200 rpm時，BRP提取量持續(xù)增加，在剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm時，BRP 提取量達(dá)到最大值，為15.72±0.27 mg/g，存在著顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)剪切轉(zhuǎn)速超過16 200 rpm時，BRP提取量不斷下降。這可能由于剪切力過大，破壞了多酚類物質(zhì)(如黃酮母核)的結(jié)構(gòu)，從而影響了BRP的得率[17]。因此，選用剪切轉(zhuǎn)速13 400～19 000 rpm作為響應(yīng)面參考因素。

圖3 剪切轉(zhuǎn)速對BRP提取量的影響

3.1.4 剪切時間對BRP提取量的影響

由圖4所示，剪切時間在90～150 s時，增加趨勢較明顯，在150 s時，BRP 的提取量達(dá)到最大，為15.73±0.23 mg/g，存在著顯著性差異(P<0.05)。在150～210 s時，變化趨勢平緩。這是因為高轉(zhuǎn)速剪切使白及須根細(xì)胞壁被有效地破壞，讓活性成分可以充分溶于溶液中，從而BRP的提取量得到增加[17]。因此，選用150 s作為后續(xù)實驗的固定條件，但不作為響應(yīng)面實驗考察因素。

圖4 剪切時間對BRP提取量的影響

3.1.5 剪切溫度對BRP提取量的影響

由圖5所示，溫度在30～40 ℃時，伴隨溫度的升高 BRP 提取量迅速增加，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時，BRP 提取量達(dá)到最大，為16.22±0.19 mg/g，存在著顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)溫度繼續(xù)上升，BRP 提取量轉(zhuǎn)而呈下降趨勢，這與多酚類物質(zhì)的熱穩(wěn)定性相關(guān)，高溫條件下，多酚類成分會發(fā)生降解，導(dǎo)致多酚的含量的降低[18]。因此，選用溫度30～50 ℃作為響應(yīng)面參考因素。

圖5 剪切溫度對BRP提取量的影響

3.1.6 料液比對BRP提取量的影響

由圖6所示，料液比在1∶20～1∶50 g/mL時，伴隨料液比的升高，BRP提取量快速增加；當(dāng)料液比繼續(xù)增加，BRP 提取量增加不明顯，料液比為1∶60 g/mL時，BRP 提取量達(dá)到最大，為15.97±0.68 mg/g。這是因為增加料液比，可以使樣品與溶劑充分接觸，促進(jìn)更多活性物質(zhì)溶于溶液中，有助于多酚提取率的提高[19]，當(dāng)料液比在1∶50 g/mL時，已達(dá)到平衡，在繼續(xù)增加料液比對多酚的提取量影響可以忽略不計。因此，可以選用1∶50 g/mL作為后續(xù)實驗的固定條件，但不作為響應(yīng)面實驗考察因素。

圖6 料液比對BRP提取量的影響

3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

3.2.1 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果分析

單因素實驗結(jié)果表明，提取條件為甘油濃度占50%、pH值為4、剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm、剪切時間為150 s、剪切溫度為40 ℃、料液比為1∶50 g/mL時，白及須根多酚的提取量均達(dá)到最大。固定剪切時間150 s、料液比1∶50 g/mL的條件下，以白及須根多酚提取量為響應(yīng)值(Y)，響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。

表2 多酚提取的響應(yīng)面實驗結(jié)果

3.2.2 回歸方程的建立與顯著性檢驗

以白及須根多酚提取量為響應(yīng)值(Y)，得到多酚提取量對各影響因素的二次多項式回歸模型為：Y=19.06+0.58A+0.29B+0.30C+0.65D-0.58AB-0.65AC-0.26AD-0.59BC-0.095BD+0.018CD-0.77A2-0.64B2-0.80C2-0.69D2。

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析可知，該實驗選用的模型極顯著(P<0.01)，變異系數(shù)CV=2.46%<5%，說明模型實驗預(yù)測性高、穩(wěn)定性好。方差的失擬項不顯著(P=0.579 5>0.05)，表明模型選擇合適。因此，實驗真實點對結(jié)果的分析可用回歸方差進(jìn)行代替。

據(jù)表 3 顯示，在此實驗設(shè)計中，一次項A、B、C和D對 BRP 提取量的影響均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。從顯著性檢驗P值的大小可以得到各因素對 BRP 提取量影響的順序為溫度(D)> 甘油濃度(A)>剪切轉(zhuǎn)速(C)>pH(B)。由圖7可知，甘油濃度和pH、甘油濃度和剪切轉(zhuǎn)速、pH和剪切轉(zhuǎn)速的交互作用對BRP 提取量影響是顯著的。

表3 回歸模型方差分析

圖7 因素交互作用對BRP提取量的影響

3.2.3 最佳工藝條件及驗證實驗

通過回歸模型求解方程，得到最佳的提取條件為：甘油濃度為52.55%，pH為4.05，剪切轉(zhuǎn)速為16 387.88 rpm，剪切溫度為44.22 ℃時，預(yù)測BRP提取量為19.28 mg/g。但考慮到實際操作的局限性，將提取條件調(diào)整為：甘油濃度為53%、pH為4、剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm、剪切溫度為44 ℃。根據(jù)此條件進(jìn)行驗證性實驗，得到BRP的提取量為19.02±0.33 mg/g，與預(yù)測值19.28 mg/g的相對誤差為1.35%，表明此響應(yīng)面法得到的回歸模型具有較好的可靠性。

3.3 BRP抗氧化活性

3.3.1 BRP對ABTS自由基的清除能力

如表4所示，BRP對ABTS 自由基有較強(qiáng)的清除作用，隨著BRP質(zhì)量濃度的增加，BRP對ABTS自由基的清除率逐漸增強(qiáng)，在0.2 mg/mL時，其ABTS自由基清除率時可達(dá)到94.39%。BRP和Vc 對 ABTS自由基清除作用的IC50值(指清除率為50%時，所需要樣品的有效質(zhì)量濃度)分別為0.013和0.016 mg/mL，表明白及須根多酚的ABTS自由基清除能力與Vc相當(dāng)。

表4 BRP對ABTS自由基的清除作用

3.3.2 BRP對DPPH自由基的清除能力

如表5所示，BRP對 DPPH 自由基具有較好的清除作用，在0.012 5～0.2 mg/mL濃度內(nèi)，BRP對DPPH自由基的抑制率分別為28.88%、30.62%、51.58%、72.35%、88.86%，即隨BRP質(zhì)量濃度的增加，DPPH 自由基清除率隨之增強(qiáng)。BRP和Vc的DPPH自由基清除作用的IC50值分別為0.064、0.052 mg/mL。結(jié)果表明，白及須根多酚對DPPH自由基清除能力的變化規(guī)律與對ABTS自由基清除能力的變化規(guī)律一致，說明白及須根的抗氧化能力主要來自于多酚類物質(zhì)。

表5 BRP對DPPH自由基的清除作用

3.3.3 BRP的還原能力

測定白及須根多酚對Fe3+的還原力，實際上是對樣品的供電子能力進(jìn)行檢驗，吸光值越大，表明還原能力越強(qiáng)。如表6所示，BRP 具有較好的還原能力，在0.012 5～0.2 mg/mL內(nèi)，BRP 的還原能力與濃度有明顯的依賴性。BRP和Vc的IC50值(指OD值達(dá)到0.5時，所需要樣品的有效質(zhì)量濃度)分別為0.166、0.043 mg/mL。

表6 BRP的還原能力

3.4 BRP對酪氨酸酶的抑制活性

如表 7 所示，BRP 對酪氨酸酶具有顯著的抑制活性，在0.012 5～0.200 0 mg/mL濃度內(nèi)，BRP對酪氨酸酶的抑制率分別為2.44%、14.52%、32.05%、49.63%、70.82%。BRP和Vc的酪氨酸酶抑制能力與其質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)：BRP質(zhì)量濃度(X)與酪氨酸酶抑制能力(Y)間的回歸方程為Y=343.65X+ 7.2583，陽性對照Vc質(zhì)量濃度(X)與酪氨酸酶抑制能力(Y)間的回歸方程為Y=151.16X+6.616 3。BRP和Vc的酪氨酸酶抑制作用IC50值分別為0.124、0.287 mg/mL。由此可見，白及須根多酚的酪氨酸酶抑制活性優(yōu)于陽性對照Vc。研究顯示[20]，多酚類物質(zhì)能夠有效抑制酪氨酸酶活性，具有良好的美白作用效果。

表7 BRP對酪氨酸酶的抑制作用

4 結(jié)論

采用綠色溶劑甘油聯(lián)合高剪切分散乳化技術(shù)提取白及須根多酚，并通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化BRP提取工藝，得到最佳工藝條件為：甘油濃度為53%、pH為4、剪切轉(zhuǎn)速為16 200 rpm、剪切溫度為44 ℃，在此條件下預(yù)測提取量為19.28 mg/g，實際提取量為19.02 mg/g，理論值與實際值相符，結(jié)果可行。因此，白及須根多酚的提取制備可用此模型，該模型也為將來白及須根廢棄物資源的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)，具有一定的應(yīng)用價值。

體外生物活性實驗結(jié)果表明，BRP具有良好的ABTS、DPPH自由基清除能力和還原能力，其抗氧化活性與濃度呈顯著正相關(guān)。BRP能顯著抑制酪氨酸酶活性，且抑制效果優(yōu)于陽性對照Vc。本研究結(jié)果揭示了多酚類物質(zhì)是白及須根發(fā)揮抗氧化、酪氨酸酶抑制作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，表明白及須根多酚在深度開發(fā)成美白功能性化妝品領(lǐng)域具有較好的潛力。