賽北紫堇中的酚類成分及其細胞毒活性研究

南澤東，韓廣田，李喜安，任華忠，魚 江，王壽峰，郭 力

1成都中醫藥大學藥學院 西南道地藥材協同創新中心 中藥資源系統研究與開發利用國家重點實驗室，成都 611137；2樂山職業技術學院，樂山 614000；3四川輕化工大學化工學院，自貢 743000

賽北紫堇Corydalisimpatiens為罌粟科紫堇屬植物，彝族藥名瓦都，為一年生或兩年生草本，全草入藥，具有清熱解毒、消腫鎮痛之功效[1]，生長于海拔1 700 m附近的林下、山坡灌叢下、草叢中或地邊路旁。主要分布于內蒙古、甘肅、青海、四川及西藏等地[2]。目前，已有多篇文獻[3,4]對該屬植物的化學成分及其藥理活性進行了綜述，表明該屬植物主要含有生物堿類成分，之外還含有黃酮、甾體、揮發油等成分，具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗炎鎮痛、抗心律失常、保肝等。由于生長環境、產量等原因，對賽北紫堇的現代研究一直滯后，極大地限制了其藥用價值的發揮。目前，已有的對賽北紫堇研究的報道，主要集中在質量標準[5]、含量測定[6]、總生物堿藥理活性[7]以及化學成分[8]的研究。為進一步闡明該藥材的藥效物質基礎，本實驗采用硅膠柱色譜、凝膠Sephadex LH-20色譜、半制備高效液相色譜等分離技術對賽北紫堇成分進行分離，并采用四甲基唑藍(MTT)法測定化合物對人肝癌HepG2和SMMC-7721細胞的體外抑制活性。

1 儀器與材料

Bruker-600M、Bruker-400M 核磁共振儀(德國Bruker公司)；Agilent 6320 型質譜儀(美國Agilent 公司)；X-4 型顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司制造，溫度未校正)；Hanon P850 全自動型旋光儀(濟南海能儀器股份有限公司)；LC-3000高效液相色譜儀(北京創新通恒科技有限公司)；Agilent Eclipse XDB-C18(10 mm × 250 mm，5 μm)半制備色譜柱；CO2培養箱(日本SANYO公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；DNM-9602G型全自動酶標儀(北京普朗新技術有限公司)；BD Transwell 小室(美國Corning公司)；薄層色譜和柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)，ODS柱色譜材料(德國Merk公司)，Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia 公司)；HPLC試劑(美國MREDA公司)，實驗過程中所用的乙醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮為分析純(天津大茂化學試劑廠)。DMEM培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(上海生工生物工程公司)；四甲基唑藍(美國Sigma公司)。

賽北紫堇藥材2016年10月購于西藏拉薩藥材市場，由四川省食品藥品學校秦運潭副教授鑒定為賽北紫堇Corydalisimpatiens，標本現存于樂山職業技術學院藥學系(No.CI201610)。細胞毒活性測試所用的人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞由四川大學華西基礎醫學與法醫學院提供。

2 試驗方法

2.1 提取分離

干燥賽北紫堇藥材15 kg，粉碎后用90%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并3次提取液，減壓濃縮得浸膏1 kg。取浸膏加適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶劑后分別得到石油醚部位95 g，乙酸乙酯部位260 g，正丁醇部位320 g。采用酸溶堿沉法對260 g乙酸乙酯部位進行處理，將其分散到2 L蒸餾水中，用1 mol/LHCl調PH至3～4，濾去不溶物得酸性部位160 g，然后用1 mol/LNaOH調PH至9～10，得到堿性部位63 g。

堿性部位(63 g)進行硅膠柱(200～300目，1.2 kg)色譜分離，用二氯甲烷-甲醇(50∶1、20∶1、10∶1、4∶1、2∶1)梯度洗脫，得到10個主要流分B.1～B.10。B.3經硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮(3∶1→1∶3)梯度洗脫，得到8個主要流分B.3-1～B.3-8。B.3-2經HPLC(30%乙腈-水)色譜分離，得化合物17(8 mg)。B.3-6反復經Sephadex LH-20凝膠柱(二氯甲烷-甲醇，1∶1)純化得化合物14(6 mg)；B.5經硅膠柱色譜，用石油醚-二氯甲烷-甲醇(10∶10∶1→2∶2∶1)梯度洗脫，得到10個主要流分B.5-1～B.5-10。B.5-8經HPLC(15%乙腈-水)色譜分離，得化合物15(4 mg)和20(5 mg)；B.6經HPLC(10%乙腈-水)色譜分離，得化合物13(8 mg)、16(12 mg)和18(20 mg)；B.9反復經Sephadex LH-20凝膠柱(二氯甲烷/甲醇，1∶1)色譜分離，得化合物12(11 mg)；B.10經硅膠柱色譜，用石油醚-二氯甲烷-甲醇(3∶3∶1)洗脫，得化合物19(4 mg)。

酸性部位(160 g)進行硅膠柱(200～300目，1.2 kg)色譜分離，用二氯甲烷-甲醇(50∶1、20∶1、10∶1、4∶1、2∶1)梯度洗脫，得到12個主要流分Fr.1～Fr.10。Fr.3經Sephadex LH-20凝膠柱(二氯甲烷-甲醇，1∶1)色譜分離，得到2個主要流分Fr.3-1～Fr.3-2。Fr.3-1經HPLC(45%乙腈-水)色譜分離，得化合物10(12 mg)；Fr.4經硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮(3∶1→1∶3)梯度洗脫，得到4個主要流分Fr.4-1～Fr.4-4。Fr.4-3經HPLC(40%乙腈-水)色譜分離，得化合物1(5 mg)和9(10 mg)；Fr.5經ODS色譜分離，用甲醇-水(20%、40%、60%)梯度洗脫，得到3個主要流分Fr.5-1～Fr.5-3。Fr.5-2經HPLC(30%乙腈-水)色譜分離，得化合物7(3 mg)和8(6 mg)；Fr.6經ODS色譜分離，用甲醇-水(20%、40%、60%)梯度洗脫，得到4個主要流分Fr.6-1～Fr.6-4。Fr.6-2經HPLC(35%甲醇-水)色譜分離，得化合物11(8 mg)和6(13 mg)；Fr.10經硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇(10∶1、6∶1、4∶1、2∶1)梯度洗脫，得到5個主要流分Fr.10-1～Fr.10-5。Fr.10-3經HPLC(18%乙腈-水)色譜分離，得化合物3(15 mg)；Fr.10-4反復經HPLC(15%乙腈-水)色譜分離，得化合物5(20 mg)、2(24 mg)和4(13 mg)。

2.2 活性測試

用MTT法進行測試，將分離得到的20個酚類化合物分別用DMSO溶解后配成10 mmol/L儲備液，臨用前稀釋。將對數生長期人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721以2×103個/cm2的密度接種到96孔板中，每孔100 μL，并設空白組、對照組以及給藥組，每組設3個平行孔，于5% CO2，37 ℃培養24 h。然后更換為受試化合物分別為2.5、5.0、10、20、40 μmol/L的含藥培養基，繼續培養48 h后，更換為無血清培養基，避光條件下每孔加入5 mg/mL體積為20 μL的MTT溶液，繼續于37 ℃孵化4 h，然后棄去培養液，每孔加入DMSO 150 μL振搖10 min后用酶標儀測量波長在570 nm處的吸光度OD值。按下述公式計算化合物對HepG2、SMMC-7721細胞增殖的抑制率。抑制率=(OD對照-OD加藥)/(OD對照-OD空白)×100 %。實驗重復3次，取平均值并用SPSS軟件計算化合物的半數抑制濃度IC50值。

3 實驗結果

3.1 結構鑒定

化合物2為淡黃色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z409[M+H]+，結合13C NMR數據給出分子式為C22H16O8，不飽和度為15。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.78(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.48(1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6′)，7.10(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′′，H-7′′)，6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.63(2H，d，J=8.4 Hz，H-4′′，6′′)，6.28(1H，s，H-6)，4.06(2H，s，H-1′′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：148.1(C-2)，137.0(C-3)，177.5(C-4)，155.5(C-5)，98.8(C-6)，160.3(C-7)，107.8(C-8)，163.0(C-9)，104.5(C-10)，124.4(C-1′)，116.2(C-2′)，146.1(C-3′)，148.7(C-4′)，116.3(C-5′)，121.6(C-6′)，28.2(C-1′′)，133.2(C-2′′)，130.2(C-3′′，7′′)，116.0(C-4′′，6′′)，156.3(C-5′′)。以上數據與文獻[10]報道一致，故鑒定該化合物為8-對羥芐基槲皮素。

化合物3為淡黃色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z393[M+H]+，結合碳譜數據得到其分子式為C22H16O7，不飽和度為15。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，7.06(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′′，H-7′′)，6.85(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.64(2H，d，J=8.4 Hz，H-4′′，6′′)，6.29(1H，s，H-6)，4.06(2H，s，H-1′′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：148.1(C-2)，137.0(C-3)，177.6(C-4)，155.7(C-5)，98.8(C-6)，160.4(C-7)，107.6(C-8)，163.1(C-9)，104.6(C-10)，123.9(C-1′)，130.8(C-2′,6′)，116.2(C-3′，5′)，160.5(C-4′)，28.2(C-1′′)，133.1(C-2′′)，130.1(C-3′′，7′′)，116.0(C-4′′，6′′)，156.4(C-5′′)。以上數據與文獻[11]報道一致，故鑒定該化合物為8-對羥芐基山奈酚一致。

化合物4為淡黃色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z409[M+H]+，結合13C NMR 數據給出分子式為C22H16O8，不飽和度為15。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.73(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.62(1H，dd，J=1.8，8.4 Hz，H-6′)，7.14(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′′，H-7′′)，6.87(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.62(2H，d，J=8.4 Hz，H-4′′，6′′)，6.44(1H，s，H-8)，3.86(2H，s，H-1′′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：147.7(C-2)，137.2(C-3)，177.3(C-4)，159.3(C-5)，112.7(C-6)，160.5(C-7)，93.7(C-8)，156.3(C-9)，104.4(C-10)，124.3(C-1′)，116.0(C-2′)，146.2(C-3′)，148.7(C-4′)，116.2(C-5′)，121.6(C-6′)，27.8(C-1′′)，133.6(C-2′′)，130.6(C-3′′，7′′)，115.7(C-4′′，6′′)，156.1(C-5′′)。以上數據與文獻[12]報道一致，故鑒定該化合物為6-對羥芐基槲皮素。

化合物5為淡黃色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z303[M+H]+，結合13C NMR數據給出分子式為C15H10O7，不飽和度為11。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.50(1H，s，5-OH)，7.69(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，7.55(1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6′)，6.89(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：146.3(C-2)，135.2(C-3)，175.3(C-4)，155.6(C-5)，97.7(C-6)，163.4(C-7)，92.8(C-8)，160.2(C-9)，102.5(C-10)，121.4(C-1′)，114.5(C-2′)，144.5(C-3′)，147.2(C-4′)，115.1(C-5′)，119.4(C-6′)。以上數據與文獻[13]報道一致，故鑒定該化合物為槲皮素。

化合物6為淡黃色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z287[M+H]+，結合13C NMR 數據給出分子式為C15H10O6，不飽和度為11。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：8.07(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.37(1H，s，H-8)，6.17(1H，s，H-6)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：148.0(C-2)，137.1(C-3)，177.3(C-4)，162.5(C-5)，99.3(C-6)，165.6(C-7)，94.5(C-8)，158.2(C-9)，104.5(C-10)，123.7(C-1′)，130.7(C-2′，6′)，116.3(C-3′，5′)，160.5(C-4′)。上述數據與文獻[14]對照基本一致，故鑒定該化合物為山奈酚。

化合物7為淡黃色無定形粉末，ESI-MS：m/z301[M+H]+，結合13C NMR 數據給出分子式為C16H12O6，不飽和度為11。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.97(1H，s，5-OH)，7.56(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.55(1H，dd，J=1.8，8.4 Hz，H-6′)，6.93(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.87(1H，s，H-3)，6.47(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，3.89(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：163.5(C-2)，103.1(C-3)，181.6(C-4)，161.4(C-5)，99.0(C-6)，164.9(C-7)，94.1(C-8)，157.4(C-9)，103.1(C-10)，120.3(C-1′)，110.1(C-2′)，150.9(C-3′)，148.0(C-4′)，115.8(C-5′)，120.3(C-6′)，55.9(3′-OCH3)。上述數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定該化合物為金圣草黃素。

化合物8為淡黃色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z287[M-H]-，結合碳譜數據得出分子式為C15H12O6，不飽和度為10。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：13.12(1H，s，1-OH)，7.37(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)，7.15(1H，d，J=9.2 Hz，H-5)，6.35(1H，d，J=2.4 Hz，H-4)，6.32(1H，d，J=2.4 Hz，H-2)，5.97(1H，s，7-OH)，4.03(3H，s，8-OCH3)，3.88(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：163.6(C-1)，97.0(C-2)，166.5(C-3)，92.1(C-4)，157.2(C-4a)，113.8(C-5)，122.5(C-6)，144.3(C-7)，150.7(C-8)，114.7(C-8a)，180.6(C-9)，104.0(C-9a)，145.5(C-10a)，55.8(3-OCH3)，62.8(8-OCH3)。以上數據與文獻[16]報道基本一致，故鑒定該化合物為1，7-二羥基-3，8-二甲氧基口山酮。

化合物9為淡黃色無定形粉末，ESI-MS：m/z301[M-H]-，結合13C NMR數據給出分子式為C16H14O6，不飽和度為10。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：12.68(1H，s，1-OH)，7.64(1H，dd，J=1.6，8.0 Hz，H-8)，7.17(1H，t，J=8.0 Hz，H-7)，7.09(1H，dd，J=1.6，8.0 Hz，H-6)，6.46(1H，s，H-4)，3.93(3H，s，5-OCH3)，3.90(3H，s，3-OCH3)，3.87(3H，s，2-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：153.8(C-1)，131.6(C-2)，159.7(C-3)，90.7(C-4)，152.8(C-4a)，148.0(C-5)，115.2(C-6)，123.3(C-7)，116.2(C-8)，120.7(C-8a)，180.7(C-9)，103.9(C-9a)，145.9(C-10a)，56.1(2-OCH3)，56.2(3-OCH3)，60.6(8-OCH3)。上述數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定該化合物為1-羥基-2，3，5-三甲氧基口山酮。

化合物10為淡黃色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z331[M-H]-，結合13C NMR數據給出分子式為C17H16O7，不飽和度為10。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：12.48(1H，s，1-OH)，7.63(1H，dd，J=1.6，8.0 Hz，H-7)，7.19(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，7.13(1H，d，J=1.6 Hz，H-5)，4.10(3H，s，3-OCH3)，3.96(3H，s，6-OCH3)，3.94(3H，s，2-OCH3)，3.89(3H，s，4-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：150.2(C-1)，132.5(C-2)，153.9(C-3)，135.2(C-4)，145.4(C-4a)，115.7(C-5)，148.4(C-6)，116.1(C-7)，123.4(C-8)，120.5(C-8a)，181.3(C-9)，104.7(C-9a)，146.0(C-10a)，61.6(2-OCH3)，61.5(3-OCH3)，60.9(4-OCH3)，56.2(6-OCH3)。以上波譜數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定該化合物為1-羥基-2，3，4，6-四甲氧基口山酮。

化合物11為無色油狀物，ESI-MS：m/z287[M+H]+，結合13C NMR數據給出分子式為C16H14O5，不飽和度為10。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.62(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，7.61(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.51(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，7.11(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6)，6.89(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.87(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.38(1H，d，J=15.6 Hz，H-8)，3.90(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：127.0(C-1)，111.3(C-2)，148.7(C-3)，149.8(C-4)，116.2(C-5)，123.8(C-6)，145.6(C-7)，115.9(C-8)，169.0(C-9)，145.9(C-1′)，130.9(C-2′，6′)，116.6(C-3′，5′),160.4(C-4′)，56.3(3-OCH3)。以上波譜數據與文獻[19]報道一致，故鑒定該化合物為p-hydroxyphenylferulate。

化合物12為無色針狀晶體(CH3OH)，熔點為268～269 ℃；UV254下顯亮藍色熒光；ESI-MS：m/z177[M-H]-，結合碳譜數據得出其分子式為C9H6O4，不飽和度為7。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.77(1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，6.93(1H，s，H-5)，6.75(1H，s，H-8)，6.17(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：164.3(C-2)，112.8(C-3)，146.0(C-4)，112.5(C-4a)，113.0(C-5)，144.5(C-6)，152.0(C-7)，103.6(C-8)，150.5(C-8a)。以上波譜數據與文獻[20]報道一致，故鑒定該化合物為5，7-二羥基香豆素一致。

化合物13為淡黃色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z229[M-H]-，結合13C NMR數據給出分子式為C14H14O3，不飽和度為8。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.15(4H，d，J=8.4 Hz，H-2，6，2′，6′)，6.75(4H，d，J=8.4 Hz，H-3，5，3′，5′)，4.39(4H，s，H-7，7′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：130.3(C-1,1′)，130.8(C-1，6，2′，6′)，116.1(C-3，5，3′，5′)，158.3(C-4，4′)，72.7(C-7，7′)。以上波譜數據與文獻[21]報道一致，故鑒定該化合物為4，4′-二羥基二芐醚。

化合物14為白色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z167[M-H]-，結合13C NMR數據給出分子式為C9H12O3，不飽和度為4。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.79(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.70(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，6.64(1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-6)，3.83(3H，s，3-OCH3)，3.70(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，2.73(2H，t，J=7.2 Hz，H-7)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：131.8(C-1)，113.7(C-2)，148.8(C-3)，145.9(C-4)，116.1(C-5)，122.4(C-6)，39.8(C-7)，64.5(C-8)，56.3(3-OCH3)。以上波譜數據與文獻[22]報道一致，故鑒定該化合物為3-甲氧基-4-羥基苯乙醇。

化合物15白色無定形粉末，ESI-MS：m/z153[M-H]-，結合13C NMR數據給出分子式為C8H10O3，不飽和度為4。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.67(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，6.64(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.52(1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-6)，3.67(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，2.66(2H，t，J=7.2 Hz，H-7)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：131.8(C-1)，117.1(C-2)，146.1(C-3)，144.6(C-4)，116.3(C-5)，121.2(C-6)，39.8(C-7)，64.6(C-8)。以上數據與文獻[23]報道一致，故鑒定該化合物為3，4-二羥基苯乙醇。

化合物16白色針狀晶體(甲醇)，熔點為92～94 ℃；UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z137[M-H]-，結合13C NMR數據給出分子式為C8H10O2，不飽和度為4。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.03(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.70(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，3.68(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，2.71(2H，t，J=7.2 Hz，H-7)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：131.0(C-1)，130.9(C-2，6)，116.1(C-3，5)，156.8(C-4)，39.4(C-7)，64.6(C-8)。上述數據與文獻[24]報道基本一致，故鑒定該化合物為對羥基苯乙醇。

化合物17為白色無定形粉末，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z151[M-H]-，結合13C NMR數據給出分子式為C9H12O2，不飽和度為4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.19(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.77(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，4.43(2H，s，H-7)，3.53(2H，q，J=7.2 Hz，H-1′)，1.23(3H，t，J=7.2 Hz，H-2′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：130.4(C-1)，115.2(C-2，6)，129.6(C-3，5)，155.3(C-4)，72.4(C-7)，65.5(C-1′)，15.2(C-2′)。以上波譜數據與文獻[25]報道一致，故鑒定該化合物為對羥芐基乙基醚。

化合物18白色針狀晶體(CH3OH)，熔點為114～120 ℃，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z123[M-H]-，結合13C NMR 數據給出分子式為C7H8O2，不飽和度為4。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.16(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.75(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，4.48(2H，s，H-7)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：133.5(C-1)，116.1(C-2，6)，129.8(C-3，5)，157.8(C-4)，65.1(C-7)。以上數據與文獻[26]報道一致，故鑒定該化合物為對羥基苯甲醇。

化合物19為白色針狀晶體(CH3OH)，熔點為139～141℃，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z125[M-H]-，結合13C NMR數據給出分子式為C6H6O3，不飽和度為4。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.43(1H，d，J=1.8 Hz，H-3)，7.40(1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-5)，6.77(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：123.6(C-1)，145.9(C-2)，115.6(C-3，5)，150.8(C-4)，117.8(C-6)。以上波譜數據與文獻[27]報道一致，故鑒定該化合物為1，2，4-苯三酚。

化合物20為白色片狀晶體(CH3OH)，熔點為102～103 ℃，UV254下顯暗斑；ESI-MS：m/z109[M-H]-，結合13C NMR 數據得到分子式為C6H6O2，不飽和度為4。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.87(2H，dd，J=1.8，7.2 Hz，H-3，6)，6.80(2H，dd，J=1.8，7.2 Hz，H-4，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：163.1(C-1，2)，132.9(C-4，5)，116.0(C-3，6)。以上波譜數據與文獻[28]報道一致，故鑒定該化合物為鄰二苯酚。

3.2 活性測試結果

測試結果(見表1)顯示化合物2、3對人肝癌HepG2具有中等抑制活性，IC50值分別為16.8和19.2 μmol/L(陽性對照藥順鉑IC50值為4.8 μmol/L)；化合物11對人肝癌SMMC-7721具有較弱的抑制活性，IC50值分別為24.6 μmol/L(陽性對照藥順鉑IC50值為5.4 μmol/L)；其他化合物對人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721沒有明顯的抑制作用(IC50值都大于40 μmol/L)。

表1 化合物1～20的體外抗腫瘤活性

5 討論

本課題對賽北紫堇90%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位化學成分進行系統研究，研究結果表明該植物中主要含有生物堿類成分(另文報道)，酚類成分。同時也對所有分離得到的酚類化合物進行了抗人肝癌細胞HepG2和SMMC-7721細胞毒活性測試，結果顯示化合物2和3對人肝癌HepG2具有中等抑制活性，化合物11對人肝癌SMMC-7721具有較弱的抑制活性，而其他酚類化合物對上述兩種受試癌細胞沒有明顯的抑制作用。本研究將為該藥材的藥效物質基礎的闡明、進一步的質量控制及其他藥理作用的深入研究具有一定的參考價值。