土牛膝抗炎成分分離、鑒定與含量測定研究

歐陽文，羅懿釩，李 震，王雄龍，張云坤，周華榮，唐純玉*，李順祥

1湖南中醫(yī)藥大學藥學院，長沙 410208；2湖南時代陽光藥業(yè)股份有限公司，永州 410116；3湖南食品藥品職業(yè)學院；4湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心，長沙 410208；5湖南省抗感染中藥工程技術(shù)研究中心；6湖南時代陽光博士后科研流動站協(xié)作研發(fā)中心，永州 410116

土牛膝別名倒鉤草、倒梗草等，來源較為復雜，包括莧科植物粗毛牛膝AchyranthesasperaLinnacus、柳葉牛膝A.longifolia(Makino)Makino及牛膝A.bidentataBlume野生種的干燥根及根莖。具有活血祛瘀，瀉火解毒，利尿通淋之功效。主治閉經(jīng)，跌打損傷，風濕關(guān)節(jié)痛，痢疾，白喉，咽喉腫痛，瘡癰，淋證，水腫[1]。“喉咽清”來源于民間驗方，由土牛膝、馬蘭草、車前草和天名精四位藥味組成，土牛膝為君藥，具有清熱解毒和利咽止痛的功效，主要用于肺胃實熱所導致的咽部腫痛、發(fā)熱、口渴、便秘、扁桃體炎、咽炎等證[2]。喉咽清口服液(顆粒)為國家重點新產(chǎn)品和國家醫(yī)保目錄品種，在新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)防治中，于2020年2月7日被湖南省衛(wèi)生健康委員會納入《湖南省兒童新型冠狀病毒感染臨床診斷與治療專家共識(試行第一版)》，用于兒童新型冠狀病毒感染的防治，適于咽痛偏于風熱者[3]。

土牛膝提取物具有很好的抗炎功效，Rao等[4]建立家兔聲帶炎癥模型，觀察研究了土牛膝提取物對大白兔急性咽喉炎的治療作用，結(jié)果表明土牛膝提取物可以顯著抑制家兔急性咽喉炎的癥狀。Ou等[5]研究土牛膝提取物的抗炎作用，結(jié)果表明土牛膝提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹和雞蛋清引起的大鼠足跖腫脹以及急性炎癥導致的腹腔毛細血管通透性均有不同程度的抑制作用。前期本課題組對土牛膝化學成分進行了系統(tǒng)研究，已經(jīng)分得16個單體化合物，包括蛻皮甾酮類和齊墩果酸為苷元的三萜皂苷類，還分得生物堿、脂肪酸及一種新異黃酮類化合物[6,7]。以脂多糖刺激小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7，可以誘導細胞產(chǎn)生多種相關(guān)介質(zhì)和細胞因子如NO、tumor necrosis factor-α(TNF-α)、interleukin-6(IL-6)、cyclooxygenase-2(COX-2)等而形成炎癥細胞模型，此模型被廣泛應用于抗炎藥物的篩選評價。NO作為眾多炎癥介質(zhì)中的重要因子之一，在調(diào)節(jié)多種生理功能方面起重要作用，例如血管擴張、神經(jīng)傳遞和炎癥應答等，其濃度可以用來評價炎癥反應的強弱程度[8]。為進一步明確土牛膝抗炎活性成分，本課題組建立脂多糖刺激的RAW264.7炎癥模型，分析不同土牛膝的抗炎作用，并在活性指導下對粗毛牛膝抗炎成分進行分離純化，鑒定結(jié)構(gòu)并測定主要活性成分含量隨季節(jié)變化規(guī)律，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

粗毛牛膝(A.asperaLinnacus)和柳葉牛膝(A.longifolia(Makino)Makino)采自湖南永州馬鞍嶺瑤家寨湖南時代陽光藥業(yè)股份有限公司種植基地，野生牛膝(A.bidentataBl.野生種)采自湖南長沙湖南中醫(yī)藥大學藥用植物園，懷牛膝(A.bidentataBl.)采自河南焦作東巖村，以上品種均由湖南中醫(yī)藥大學藥用植物學教研室王智老師鑒定，憑證標本保存(No.2018072201(粗毛牛膝)、2018072202(柳葉牛膝)、2018072501(野生牛膝)、2018102401(懷牛膝))在湖南中醫(yī)藥大學中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心。

1.2 儀器與試劑

小鼠單核巨噬細胞株(RAW264.7)購于中科院上海細胞庫。竹節(jié)參皂苷IVa(PS010730)購買于成都普思生物科技股份有限公司，純度大于98%；脂多糖、地塞米松、二甲基亞砜、thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)(美國Sigma公司)；dulbecco’s modified eagle media(DMEM)高糖培養(yǎng)基(美國gibco公司)；胎牛血清fetal calf serum(FBS)(德國pan seratech公司)；phosphate buffered saline(PBS)磷酸鹽緩沖液(hyclone公司)；NO檢測試劑盒(碧云天公司)；色譜級乙腈、甲醇、反相硅膠板(德國默克公司)；octadecysilyl-A(ODS-A)和ODS-AQ(50 μm，日本YMC公司)；柱層析硅膠(80～100目和200～300目)，薄層色譜板(青島海洋公司)；常規(guī)提取分離用試劑甲醇等均為分析純試劑(長沙匯虹試劑公司)。

AL104萬分之一電子天平(梅特勒-托利多公司)；C18色譜柱(日本YMC公司)，LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；R204B3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順科技有限公司)；超凈工作臺(蘇州艾克林凈化設備有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；低速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；酶標儀(美國Biotek公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海齊欣科學儀器有限公司)；G2-XS QTof超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；INOVA-600 MHz高分辨超導核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司)。

2 方法

2.1 RAW264.7細胞培養(yǎng)

參照文獻[9,10]，簡述如下：將RAW264.7細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分吹打混勻，放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日在光學顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，1天更換一次培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)試驗。另外還包括細胞傳代、細胞凍存和細胞復蘇等基本操作。

2.2 活性測試樣品的制備與分離

取不同品種土牛膝和懷牛膝粉末約30 g，分別采用10、6、4倍甲醇回流提取三次，每次提取1 h，提取液過濾并減壓濃縮和冷凍干燥得醇提取物。精確稱取各提取物樣品，DMSO完全溶解(終體積不得超過0.1%)。用完全培養(yǎng)基配制成相應濃度的稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用，用0.22 μm微孔濾器除菌后測定細胞毒性和抗炎活性。

粗毛牛膝(A.asperaL.)1.17 kg，陰干過20目篩，10倍甲醇回流提取3次，每次2 h，提取液濃縮并干燥得浸膏130 g。再將浸膏與117.5 g ODS-AQ全親水性反相硅膠攪拌，低于60 ℃水浴鍋揮干溶劑，經(jīng)ODS柱層析(4cm×10 cm)，利用甲醇-水溶液梯度洗脫，其中水、10%、30%、50%、70%、90%的甲醇-水溶液和純甲醇，丙酮分別洗脫2 L，各分離部位減壓濃縮干燥后，分別得到水洗脫物(110.5 g)、10%甲醇洗脫物(1.3 g)、30%甲醇洗脫物(2.42 g)、50%甲醇洗脫物(2.99 g)、70%甲醇洗脫物(4.37 g)、90%甲醇洗脫物(4.31 g)、100%甲醇洗脫物(3.39 g)、丙酮洗脫物(1.27 g)，各部分測定活性。

合并50%～70%甲醇洗物3.0 g，用甲醇溶解后，拌硅膠10 g并揮干溶劑，過硅膠柱層析(2 cm×20 cm)，采用二氯甲烷-甲醇(98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、2∶1、1∶1，純甲醇)梯度洗脫，共獲得40組分，其中Fr.15(二氯甲烷-甲醇90∶10洗脫)組分經(jīng)過硅膠柱層析，得到Fr.15A-E五個組分，F(xiàn)r.15B再反復通過硅膠柱，二氯甲烷-甲醇9∶1洗脫，分離得到化合物1(55 mg)和2(12 mg)；Fr.15D過ODS柱層析，40%甲醇水反復洗脫分離，得化合物3(4.7 mg)。Fr.9(二氯甲烷-甲醇95∶5洗脫)組分，先過ODS-A反相色譜柱，55%甲醇洗脫純化，并進一步經(jīng)過硅膠柱分離(二氯甲烷-甲醇97∶3洗脫)，獲得兩個主要組分(Fr.9A和Fr.9B)，組分Fr.9A進一步經(jīng)制備液相色譜(37%乙腈-水溶液)制備純化，獲得化合物4(7.0 mg)和5(4.4 mg)。組分Fr.9B進一步經(jīng)制備液相色譜(37%乙腈-水溶液)制備純化，獲得化合物6(5.0 mg)和7(5.4 mg)。Fr.30(二氯甲烷-甲醇7∶3洗脫)組分，過ODS-A反相色譜柱，65%甲醇-0.1%甲酸水溶液反復洗脫純化，獲得化合物8(4.1 mg)。Fr.6(二氯甲烷-甲醇97∶3洗脫)組分，過ODS柱色譜，水-甲醇梯度洗脫得到7個亞組分Fr.6A～G，其中Fr.6B過ODS柱色譜，50%甲醇反復洗脫，得到結(jié)晶10(2.3 mg)。

100%甲醇洗脫物，經(jīng)過ODS柱色譜，90%甲醇分離，主要化合物9(11.3 mg)以結(jié)晶形式析出。

2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過分析理化性質(zhì)，采用現(xiàn)代波譜技術(shù)(1H NMR、13C NMR及MS)方法解析，并結(jié)合對照品分析比較鑒定化合物結(jié)構(gòu)。

2.4 MTT法分析樣品細胞毒性實驗

稱取25 mg的MTT，放入10 mL的離心管中，加5 mL的PBS緩沖液，配成濃度為5 mg/mL的MTT溶液，超聲完全溶解后用0.22 μm微孔濾器除菌，4 ℃避光保存。取生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，脫壁后，用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制成單細胞懸液，用細胞計數(shù)器計數(shù)，以3×104個/孔，每孔100 μL接種于96孔板中，置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設空白組、對照組和樣品組。空白組無細胞，對照組加入含細胞的100 μL DMEM培養(yǎng)基。樣品組分別加入不同濃度樣品，使終體積為100 μL，每組設3個復孔，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，再加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育，4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，在培養(yǎng)板平臺震蕩機上震蕩10 min，置酶標儀中490 nm處測定各孔吸光值(OD值)。按公式計算細胞存活率。計算公式如下：

2.5 炎癥模型中NO釋放量檢測

處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞，脫壁后，用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，細胞計數(shù)器計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞密度為3×104個/mL，均勻接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將原培養(yǎng)液棄去，設置正常組、模型組和樣品組。正常組不加LPS和樣品；模型組在培養(yǎng)液中加入LPS溶液(終濃度1 μg/mL)；樣品組為不同濃度土牛膝提取物和單體化合物的稀釋培養(yǎng)基100 μL，每組設置3個復孔。培養(yǎng)24 h，取其上清液于離心管中。按照試劑盒說明書中的操作方法，先將培養(yǎng)基按順序加入各試劑，于波長550 nm處的酶標儀上測定各孔的吸光度值(OD值)，根據(jù)標準曲線測定NO釋放量(μM)。配置單體和提取物溶液時，DMSO(終體積不得超過0.1%)完全溶解，用完全培養(yǎng)基配制成相應濃度的稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用，并用0.22 μm微孔濾器除菌。

2.6 活性測試數(shù)據(jù)處理

2.7 反相液相色譜測定β-蛻皮甾酮條件

參照文獻[11]，島津HPLC儀(LC-20A二元高壓梯度儀，SPD-20A紫外檢測儀)，色譜柱為島津YMC C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，檢測波長250 nm，柱溫30 ℃，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(16∶84，V/V)，流速為1 mL/min。

2.8 含量測定樣品制備

2.8.1 對照品的制備

精密稱取β-蛻皮甾酮2.8 mg，置于10 mL容量瓶，加色譜甲醇溶解并定容，配置0.28 mg/mL的儲液。精密吸取儲液1 mL，置于另一10 mL容量瓶，加色譜甲醇定容，即得0.028 mg/mL的對照品溶液。

2.8.2 供試品制備

參考文獻[12]，稱取藥材粗粉(過四號篩)約0.1 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，超聲30 min(功率：40 kHz，100 W)，放冷后甲醇定容，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，精密吸取20 μL進樣，按色譜條件分析。

2.9 方法學考察

2.9.1 線性關(guān)系

精密吸取0.028 mg/mL的對照品溶液1、2、4、8、20 μL進樣，按色譜條件分析，按照進樣量(ng)和β-蛻皮甾酮峰面積計算線性回歸方程。

2.9.2 精密度試驗

精密吸取β-蛻皮甾酮對照品溶液10 μL，按照色譜條件中的方法測定，重復進樣6次。

2.9.3 重現(xiàn)性試驗

分別取同一批粉末6份，按樣品溶液的制備操作，并按色譜條件進行測定。

2.9.4 樣品穩(wěn)定性試驗

取同一份樣品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h測定β-蛻皮甾酮峰面積值。

2.9.5 回收率試驗

采用加樣回收試驗，精密吸取已知含量的柳葉牛膝粉末，加入大體相同量的對照品溶液，流動相定容至10 mL容量瓶，過膜，微量進樣器精密吸取20 μL按照色譜條件下進行測定。

3 結(jié)果

3.1 MTT法測定不同土牛膝甲醇提取物對RAW264.7細胞的毒性作用

由表1可知，柳葉牛膝和野生牛膝醇提取物在25～400 μg/mL時，細胞存活率高，且與正常組相比，無顯著性差異(P>0.05)，而粗毛牛膝和懷牛膝提取物在濃度為400～120 0 μg/mL時，細胞均有不同程度地死亡。故本研究選取濃度為50、100、200 μg/mL進行后續(xù)干預，測定抗炎活性。

表1 各提取物的細胞存活率

3.2 土牛膝各提取物對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響研究

由表2可知，對照組與模型組比較，LPS誘導RAW264.7細胞時，使NO釋放量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，懷牛膝和不同土牛膝提取物干預時，NO釋放量均有減少，且呈劑量依賴性抑制；在濃度為200 μg/mL時，三種土牛膝的抗炎作用均強于懷牛膝，對比不同土牛膝醇提取物的NO釋放量發(fā)現(xiàn)，抑制作用最強的為粗毛牛膝，NO釋放量為12.92±0.50 μM，與模型組有極顯著差異。故進一步對粗毛牛膝醇提取物進行分離，測定活性。

表2 不同提取物對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響

3.3 MTT法測定粗毛牛膝各分離部位對RAW264.7細胞的毒性作用

粗毛牛膝醇提取物經(jīng)反相柱層析分離，水-甲醇梯度洗脫得到各個洗脫組分。各部分細胞毒性結(jié)果如表3所示，除去90%甲醇洗物組外，其它部位均在濃度范圍為25～200 μg/mL時無明顯細胞毒性，細胞存活率較高；在濃度為400～120 0 μg/mL時，細胞均有不同程度地死亡。故除90%甲醇洗物組外，各洗脫組分均選取濃度為50、100、200 μg/mL進行干預，測定抗炎活性。

表3 粗毛牛膝各分離部位的細胞存活率

3.4 土牛膝各分離部位對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響研究

各洗脫部分抗炎結(jié)果如表4所示，與模型組相比，粗毛牛膝各洗脫部位作用后，NO釋放量均有減少，且呈濃度依賴性。50和100 μg/mL的濃度下，水洗物對NO釋放量無抑制作用(P>0.05)，濃度為200 μg/mL的水洗物和50、100 μg/mL的10%甲醇洗物對NO釋放量有抑制作用(P<0.05)；其他組在各濃度下對NO釋放量具有顯著抑制作用(P<0.01)。另外，30%、50%、70%、100%甲醇洗物和丙酮洗物在50、100、200 μg/mL的濃度下對NO釋放量的抑制作用均極其明顯。綜合各洗脫物得率及抗炎活性，確定50%、70%及100%甲醇洗物為重點分離對象。

表4 粗毛牛膝分離部位對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響

3.5 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色晶體;紫外光下顯暗紫色熒光，香草醛-濃硫酸反應顯藍綠色。液質(zhì)聯(lián)用分析，給出準分子離子峰[M+H]+(481.318 1)，[M+H-2H2O]+(445.297 0)，結(jié)合文獻[7]和課題組前期分離對照品，確定該化合物為β-蛻皮甾酮。

化合物2為無色針狀結(jié)晶;紫外光下可見暗紫色熒光，該化合物的比移值與β-蛻皮甾酮相似，香草醛-濃硫酸反應顯示紅色。與已知對照品比較，確定為牛膝甾酮，高效液相色譜分析顯示兩個峰。進行超高液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析，出現(xiàn)兩個峰，質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示相同準分子離子峰[M+H]+(481.316 3和481.316 0)，證明兩個化合物分子式均為C27H44O7，結(jié)合文獻比較[13]，鑒定化合物為25-R牛膝甾酮，25-S牛膝甾酮。

化合物3為白色結(jié)晶性粉末;紫外光下可見暗紫色熒光。負離子模式ESI-MS給出準分子離子峰[M+2H2O-H]-(531.271 6)，經(jīng)過與前期分離對照品在三種高效液相色譜條件下比較，確定為水龍骨甾酮B。

化合物4白色粉末狀物質(zhì);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.45(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7)，7.13(1H，s，H-2)，7.07(2H，d，J= 7.8 Hz，H-2′，6′)，7.04(1H，d，J= 7.8，H-6)，6.81(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，6.73(2H，d，J= 7.8 Hz，H-3′，5′)，6.42(1H，d，J= 15.6 Hz，H-8)，3.90(3H，s，3-OCH3)，3.48(2H，t，J= 7.2 Hz，H-8′)，2.77(2H，t，J= 7.2 Hz，H-7′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.5(s，C-9)，149.6(s，C-4)，157.2(s，C-3)，142.4(d，C-7)，128.6(s，C-1)，123.5(d，C-6)，119.0(d，C-8)，116.8(d，C-5)，111.8(d，C-2)，131.6(s，C-1′)，131.0(d，C-2′，6′)，150.1(s，C-4′)，116.6(d，C-3′，5′)，56.7(q，3-OCH3)，42.9(t，C-8′)，36.1(t，C-7′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[14,15]基本一致，鑒定為N-反式阿魏酰酪胺。

化合物5為白色粉末狀物質(zhì);核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)同化合物4基本一致，且兩者一同制備分離得到，化合物5長時間放置不太穩(wěn)定，可逐步轉(zhuǎn)化為化合物4；兩者的區(qū)別在于化合物5中δ5.83(1H，d，J= 12.6 Hz)，6.63(1H，d，J= 12.6 Hz)是一個順式雙鍵。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.38(1H，s，H-2)，6.94(1H，d，J= 7.8，H-6)，6.75(1H，d，J= 7.8 Hz,H-5)，6.63(1H，d，J= 12.6 Hz，H-7)，5.83(1H，d，J= 12.6 Hz，H-8)，3.85(3H，s，3-OCH3)，7.01(2H，d，J= 7.8 Hz，H-2′，6′)，6.70(2H，d，J= 7.8 Hz，H-3′,5′)，3.41(2H，t，J= 7.2 Hz，H-8′)，2.71(2H，t，J= 7.2 Hz，H-7′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：170.3(s，C-9)，148.5(s，C-4)，156.9(s，C-3)，138.4(d，C-7)，131.1(s，C-1)，128.5(d，C-6)，124.8(d，C-8)，115.8(d，C-5)，113.9(d，C-2)，56.3(q，3-OCH3)，131.4(s，C-1′)，130.7(d，C-2′，6′)，116.2(d，C-3′，5′)，148.5(s，C-4′)，42.3(t，C-8′)，35.5(t，C-7′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[14,15]報道一致，故鑒定為N-順式阿魏酰酪胺。

化合物6白色粉末;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.79(1H，s，H-2)，6.74(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，6.94(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6)，2.73(2H，t，J= 7.2 Hz，H-7)，3.44(2H，t，J= 7.2 Hz，H-8)，7.38(1H，s，H-2′)，6.70(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5′)，6.62(1H，m，H-6′)，6.62(1H，d，J= 12.6 Hz，H-7′)，5.84(1H，d，J= 12.6 Hz，H-8′)，3.80(3H，s，3-OCH3)，3.84(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：131.9(s，C-1)，113.9(d，C-2)，148.5(s，C-3)，148.9(s，C-4)，124.8(d，C-5)，l16.1(d，C-6)，138.3(d，C-7)，121.5(d，C-8)，170.4(s，C-9)，128.5(s，C-1′)，113.4(d，C-2′)，146.0(s，C-3′)，148.5(s，C-4′)，122.1(d，C-5′)，115.8(d，C-6′)，36.0(t，C-7′)，42.3(t，C-8′)，56.3(q，3′-OCH3)，56.2(q，3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14,15]報道一致，故鑒定為N-順式阿魏酰-3-甲氧基酪胺。

化合物7為白色粉末狀物質(zhì);核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)同化合物6基本一致，兩者一同制備分離得到，且化合物6長時間放置不太穩(wěn)定，可逐步轉(zhuǎn)化為化合物7；兩者的區(qū)別在于化合物7中δ6.33(1H，d，J= 15.6 Hz)，7.36(1H，d，J= 15.6 Hz)是一個反式雙鍵。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.75(1H，s，H-2)，6.68(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，6.60(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6)，2.70(2H，t，J= 7.3 Hz，H-7)，3.42(2H，t，J= 7.3 Hz，H-8)，7.05(1H，s，H-2′)，6.72(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.95(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6′)，7.36(1H，d，J= 15.6Hz，H-7′)，6.33(1H，d，J= 15.6 Hz，H-8′)，3.76(3H，s，3-OCH3)，3.81(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：132.0(s，C-1)，113.4(d，C-2)，149.0(s，C-3)，149.8(s，C-4)，123.2(d，C-5)，116.4(d，C-6)，142.0(d，C-7)，118.7(d，C-8)，169.2(s，C-9)，128.2(s，C-1′)，111.5(d，C-2′)，146.0(s，C-3′)，149.3(s，C-4′)，122.3(d，C-5′)，116.1(d，C-6′)，36.2(t，C-7′)，42.4(t，C-8′)，56.3(q，3′-OCH3)，56.3(q，3-OCH3)；以上數(shù)據(jù)與文獻[14,15]報道一致，故鑒定為N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺。

化合物8通過與對照品比較，在三種不同高效液相色譜條件下分析，與竹節(jié)參皂苷Ⅳa一致，故鑒定化合物8為竹節(jié)參皂苷Ⅳa。

化合物9通過與對照品比較，在三種不同高效液相色譜條件下分析，與竹節(jié)參皂苷Ⅰ一致，故鑒定化合物9為竹節(jié)參皂苷Ⅰ。

化合物10為無色針狀結(jié)晶(甲醇)，香草醛-濃硫酸反應顯紅色。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.93(1H，s，H-2)，7.38(1H，t，J= 8.4Hz，H-4′)，7.22(1H，d，J= 8.4Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J= 8.4Hz，H-3′)，6.99(1H，t，J= 8.4Hz，H-5′)，6.72(1H，s，H-8)，4.59(2H，s，H-11)，3.85(3H，s，5-OCH3)，3.78(3H，s，2′-OCH3)，3.44(3H，s，11-OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，故鑒定為5，2′-二甲氧基-6-甲氧甲基-7-羥基-異黃酮。

3.6 MTT法測定不同濃度單體化合物對RAW264.7細胞的毒性作用

選取地塞米松(dexamethasone，DXMS)為陽性對照藥物，分析10個單體的細胞毒性和抗炎活性，由表5可見，各單體化合物均在12.5～50 μM濃度范圍時對細胞無明顯毒性；在濃度為100～200 μM時，細胞均有不同程度地死亡。各單體化合物均在低于50 μM的濃度范圍內(nèi)細胞存活率較高，且與正常對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)。故各單體化合物選取12.5、25、50 μM進行NO釋放量檢測。

表5 不同濃度單體化合物的細胞存活率

3.7 單體化合物對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響研究

由表6可見，與模型組相比，陽性對照藥物地塞米松(DXMS)和各單體作用時，NO的釋放量均有減少，且呈濃度依賴性降低，各濃度下均有顯著的抑制作用(P<0.01)。在LPS+25 μM單體濃度下，化合物抗炎活性強弱依次為4>1>5>2>6>9>10>3>7>8，化合物4(N-反式阿魏酰酪胺)抗炎活性最強，但綜合比較各單體抗炎活性和在提取物及原藥材含量，β-蛻皮甾酮(1)為主要抗炎活性單體。

表6 土牛膝各單體化合物對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO的影響

3.8 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果與分析

分別吸取對照品溶液、供試樣品溶液、樣品溶液加對照品溶液各20 μL，按“色譜條件”注入液相色譜儀測定，結(jié)果表明采用本色譜條件，β-蛻皮甾酮與相鄰峰分離度好，大于1.5，且在與對照品相同的保留時間內(nèi)，空白無干擾。

3.8.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

β-蛻皮甾酮進樣量在28～560 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系好，線性方程為y=840.35x-701 3.1，R2= 0.999 7。

3.8.2 精密度試驗

精密吸取5 μL對照品溶液，連續(xù)重復進樣6次，測定峰面積并計算RSD，結(jié)果顯示β-蛻皮甾酮峰面積RSD為2.44%，表明儀器精密度好。

3.8.3 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，測定待測成分峰面積并計算RSD；結(jié)果表明β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為2.15%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8.4 重現(xiàn)性試驗

按樣品制備方法，平行制備6份供試品溶液，按色譜條件進行測定，結(jié)果表明β-蛻皮甾酮平均含量為0.060 4%，RSD為1.99%，說明方法重現(xiàn)性好。

3.8.5 加樣回收率試驗

精密稱取已測含量的柳葉牛膝粉末約0.1 g，置10 mL容量瓶中，精密加入用色譜純甲醇配置的對照品溶液2.5 mL(即加入β-蛻皮甾酮70 μg)，甲醇定容，按樣品制備方法制備加樣供試品溶液，測定并計算加樣回收率。結(jié)果如下表7所示，平均回收率為104.05%，RSD為1.54%，說明該方法測定結(jié)果準確。

表7 加樣回收率試驗結(jié)果

3.9 土牛膝不同季節(jié)蛻皮甾酮含量測定結(jié)果

對不同土牛膝和不同月份β-蛻皮甾酮含量測定，結(jié)果如下表8所示。野生牛膝(采集于湖南中醫(yī)藥大學藥用植物園)和柳葉牛膝(種植基地，兩年生)地下根莖不同月份中含量差異較大，從4月到12月季節(jié)變化過程中，含量先逐漸增加，后又逐漸降低，其中8月含量最高，分別為0.914±0.016和1.412±0.038 mg/g。8月是湖南地區(qū)溫度最高季節(jié)，說明溫度高有利于次生代謝產(chǎn)物β-蛻皮甾酮的累積。粗毛牛膝(種植基地，兩年生)β-蛻皮甾酮含量隨季節(jié)變化影響不大。

表8 不同品種土牛膝不同季節(jié)蛻皮甾酮含量測定結(jié)果

4 結(jié)論與討論

粗毛牛膝、野生牛膝和柳葉牛膝醇提取物均能劑量依賴性抑制NO量的釋放，其中以粗毛牛膝醇提取物抗炎效果最佳；粗毛牛膝醇提物過反相層析組分，50%、70%及100%甲醇洗脫物表現(xiàn)為細胞毒性低，抗炎活性高；進一步經(jīng)分離鑒定，從50%～70%甲醇洗脫物分離鑒定出9種單體化合物：β-蛻皮甾酮(1)、牛膝甾酮(2)、水龍骨甾酮 B(3)、N-反式阿魏酰酪胺(4)、N-順式阿魏酰酪胺(5)、N-順式阿魏酰-3-甲氧基酪胺(6)、N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺(7)、竹節(jié)參皂苷Ⅳa(8)、5，2′-二甲氧基-6-甲氧甲基-7-羥基-異黃酮(10)；竹節(jié)參皂苷Ⅰ(9)為100%甲醇洗脫物主要成分；體外抗炎結(jié)果表明，各單體在安全劑量范圍內(nèi)，均能劑量依賴性抑制NO量的釋放，在LPS+25 μM單體濃度下，化合物抗炎活性強弱依次為4>1>5>2>6>9>10>3>7>8，比較抗炎活性與原藥材含量，β-蛻皮甾酮(1)為主要抗炎活性單體；野生牛膝和柳葉牛膝(兩年生)地下根莖β-蛻皮甾酮含量隨季節(jié)有明顯變化，體現(xiàn)在溫度高季節(jié)含量高，溫度低含量降低；而兩年生粗毛牛膝隨季節(jié)變化規(guī)律不明顯。以上結(jié)果表明土牛膝具有顯著的抗炎作用，抗炎成分包括甾酮類、三萜皂苷、生物堿類及異黃酮類，具有抗炎活性的阿魏酰酪胺生物堿為首次從土牛膝中分離鑒定。

ODS-AQ是日本YMC公司研發(fā)的一種獨特高品質(zhì)親水性球形C18色譜填料，可用100%水系為流動相。本實驗中采用ODS-AQ柱對粗毛牛膝醇提取物進行分離，首先采用純水洗脫，將糖類或糖苷類洗脫下來，本實驗水洗物特別多，干燥后占總提取物約85%，活性測定顯示水洗物基本無抗炎活性，因此使用ODS-AQ柱對粗毛牛膝醇提取進行活性分離是成功的。水洗后，反相ODS-AQ柱繼續(xù)用甲醇-水梯度洗脫，甲醇比例逐漸增加，洗脫成分極性也逐漸降低，活性測定顯示，抗炎活性也逐漸升高，這充分說明土牛膝中起到關(guān)鍵抗炎作用的是極性較低化合物，這與文獻[16]記載“土牛膝根吹末或溫酒治療，效果更佳”是一致的。項目前期已經(jīng)從土牛膝中分離得到了幾個吲哚類生物堿，此次又首次分離鑒定了阿魏酰酪胺生物堿類，進一步豐富了土牛膝的化學資源庫，也提示進一步對土牛膝極性較低組分展開化學成分研究，將得到更多活性好和有趣的化合物。

β-蛻皮甾酮是土牛膝起抗炎的主要活性成分，含量測定結(jié)果表明野生牛膝和柳葉牛膝(兩年生)地下根據(jù)含量隨季節(jié)有明顯變化，體現(xiàn)在溫度高季節(jié)含量高，溫度低含量降低，而兩年生粗毛牛膝隨季節(jié)變化規(guī)律不明顯，這可能與粗毛牛膝地下根莖粗硬，對β-蛻皮甾酮的累積影響小。在β-蛻皮甾酮含量測定，中國藥典采用水飽和正丁醇超聲提取或甲醇提取，提取液蒸干后再甲醇溶解定容，我們在操作中發(fā)現(xiàn)，提取液蒸干后，樣品變得很黏，甲醇溶解轉(zhuǎn)移后損失大。另外在甲醇超聲提取時，超聲儀的功率和超聲時間對提取影響大，超聲提取功率為40 kHz(100 W)和超聲30 min能將β-蛻皮甾酮充分提取出來。β-蛻皮甾酮結(jié)構(gòu)中含有不飽和羰基結(jié)構(gòu)，250 nm為最大吸收波長，摩爾吸收系數(shù)大，因此0.1 g藥材置于10 mL容量瓶超聲提取，提取液用濾膜過濾測定，即使藥材中蛻皮甾酮含量低至萬分之一也在線性范圍內(nèi)。