雙斑東方鲀魚皮膠原多肽的制備及其在化妝品中的功效與刺激性評價

陳 貝，張 鴿，喬 琨，許 旻，蔡水淋，廖登遠，劉智禹*

1福建省水產研究所 國家海水魚類加工技術研發分中心(廈門)福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，廈門 361013；2集美大學食品與生物工程學院，廈門 361021

河豚魚肉味鮮美，營養豐富，尤其在亞洲國家被視為美味。雙斑東方鲀是福建省養殖河豚的主要品種之一。養殖雙斑東方鲀品質優良、毒性較低，其中魚皮與魚肉均為無毒級別，可安全食用。目前雙斑東方鲀的加工尚處于起步摸索階段，加工制品種類少且加工深度不足。魚皮作為雙斑東方鲀的無毒部分，其深度加工利用和高附加值產品的研發，對于充分利用河豚魚資源，提高加工技術含量，調整河豚魚產業結構都具有重要的意義。

水解膠原多肽能為人體膠原蛋白的合成提供優質的氨基酸原料，促進皮膚膠原蛋白合成，提高皮膚保水能力，減少皺紋形成，延緩皮膚衰老，是一種優質的化妝品添加劑。河豚魚皮中蛋白質含量占干重的80%以上，其中膠原蛋白占總蛋白質的90%左右，是一種優質的膠原蛋白及膠原多肽原料。本研究以雙斑東方鲀魚皮為實驗對象，利用堿性蛋白酶酶解獲得雙斑東方鲀魚皮膠原多肽(Fugubimaculatuscollagen peptide，FBCP)，明確最佳酶解工藝，分析不同分子量FBCP的保濕和抗氧化性能，并對FBCP皮膚刺激性和眼刺激性進行評估，為FBCP在化妝品中的應用提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗試劑

堿性蛋白酶(B8360)購于北京索萊寶科技有限公司；豬膠原多肽粉(ARTHREDTMP Standardized)和牛膠原多肽粉(ARTHREDTMStandardized)購于嘉吉生化有限公司；鄰苯三酚、水楊酸、H2O2及其他常規試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗動物

雙斑東方鲀(Fugubimaculatus)，購于漳州市漳浦縣福建鴻鲀水產養殖有限公司，生產許可證號：閩(浦漁2018)海漁苗種許字01號；成年新西蘭白兔，體重2.0～2.5 kg，實驗動物采購及刺激性評價均委托國家化妝品質量監督檢驗中心進行。

1.3 儀器

絞肉機(MM12，廣東韶關市食品機械廠)，真空冷凍干燥機(SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司)，酶標儀(M200 Pro，Tecan)，凱氏定氮儀(KjeltecTM400，FOSS)，pH計(MID5X，METTLER TOLEDO)，數顯恒溫水浴鍋(SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司)，分析天平(BSA224S，SRTORIUS)，多探頭皮膚測試系統(MPA4，CK公司)，電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9146A，上海精宏實驗設備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 雙斑東方鲀魚皮基本組分分析

分別按照GB5009.5-2010、IS03496：1994(E)、GB/T5009.3-2010、GB5009.6-2003和GB5009.4-2010，測定樣品的粗蛋白含量、羥脯氨酸含量、水分含量、脂肪含量和灰分含量。

2.2 FBCP提取工藝

雙斑東方鲀經皮肉分離后，去除魚鰭，之后將干凈的魚皮切成(約0.5×0.5 cm2)碎片，冷凍干燥，備用。凍干處理后的魚皮浸泡濃度為9% NaCl溶液(1∶30)[1]，連續攪拌24 h，每12 h換一次NaCl溶液，浸泡后用蒸餾水水洗魚并用尼龍紗過濾，重復3次，除去非膠原蛋白。

魚皮經過預處理后，按一定的料液比加入純水，調節pH和酶解溫度，加入堿性蛋白酶進行酶解。酶解完成后，100 ℃將酶滅活10 min，待酶解液冷卻至室溫，調節酶解液的pH至中性，離心取上清，經超濾膜分離得到4種不同分子量的雙斑東方鲀魚皮膠原多肽組分。冷凍干燥獲得膠原多肽粉末。

2.3 FBCP提取單因素實驗

以肽得率為指標，研究酶用量、溫度、時間、pH四個因素對雙斑東方鲀魚皮酶解效果的影響，以確定各因素的最佳酶解條件。酶解的基本條件為加酶量4 000 U/g，溫度50 ℃，時間4 h，pH 9.0，料液比1∶10。選擇固料比1∶10為固定參數，改變其他任意一個條件，分別考察酶添加量(4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g)、酶解溫度(45、50、55、60、65 ℃)、酶解時間(1、2、3、4、5 h)和pH(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)對酶解效果的影響。

2.4 FBCP提取正交試驗

本研究根據以上的單因素實驗分析結果，選擇固料比1∶10為固定參數，以肽得率為指標，設計酶解溫度、酶解時間、酶解pH值、加酶量的四因素三水平正交實驗L9(34)(表1)。

表1 正交因素水平

2.5 肽得率的測定

采用三氯乙酸(TCA)沉淀法結合甲醛滴定法測得肽得率[2]。主要原理是利用TCA沉淀酶解液中的大分子蛋白質，繼而以凱氏定氮法測定上清液中可溶性氮的含量，隨后減去上清中氨態氮(游離氨基酸)的含量，再與酶解樣品中的總氮量相比，從而確定其多肽得率。計算公如下：

蛋白肽得率=

具體方法為取酶滅活后的膠原多肽提取液10 mL，加入等量30% TCA溶液，充分混勻，靜置10 min，4 000 rpm離心10 min。取2 mL離心后的上清液，凱氏定氮測其蛋白質含量，再取2 mL上清液定容至10 mL，以酚酞作指示劑取5 mL稀釋液加入中性甲醛溶液2 mL混勻，于0.05 mol/L的標準氫氧化鈉滴定至紫紅色(pH值8.7～9.0)。記錄消耗氫氧化鈉體積。氨態氮含量計算公式如下：

其中，V1：待測液消耗氫氧化鈉體積，單位為毫升(mL)；V2：滴定空白對照消耗氫氧化鈉體積，單位為毫升(mL)；c：標準氫氧化鈉溶液的摩爾濃度；0.014：與1.00mL氫氧化鈉標準滴定溶液[(NAOH)=1.00 mol/L]相當于氮的質量(g)；m：稱取式樣的質量(g)；V3：式樣稀釋液的取用量(mL)；V4：式樣稀釋液的定容體積(mL)。

2.6 FBCP化妝品功效性研究

依次通過截留分子量為10、5、1 kDa的超濾膜，分離得到四種不同分子量的河鲀魚膠原多肽組分FBCP1(Mw<1 kDa)、FBCP2(1 kDa10 kDa)。經凍干得到四種組分河豚魚膠原多肽粉末。同時購買市售豬皮和牛皮來源的膠原多肽，同雙斑東方鲀魚皮膠原多肽進行對比。

2.6.1 吸濕保濕功效研究

將不同膠原多肽粉末置于105 ℃的烘箱中充分干燥至衡重。選用兩個相同大小的干燥器，分別在底部加入飽和硫酸銨和飽和碳酸鉀溶液，使之分別維持70%的相對濕度(RH)及40%的相對濕度(RH)，其中RH=70%模擬夏天空調房最佳濕度，RH=40%模擬冬天空調房最佳濕度。膠原多肽各取1 g分別置于兩個干燥器內，在保持環境溫度為25 ℃左右的條件下放置2、4、6、8、10 h，取出后精確稱量并計算得出吸濕率[1,3]。計算公式為：

其中：W0：放置前樣品質量(g)；Wn：放置后樣品質量(g)。

膠原多肽各取1 g分別加入2 mL蒸餾水充分溶解后置于干燥器內，放置2、4、6、8、10 h，稱量并計算出保濕率[1,3]。計算公式為：

其中：H0：放置前樣品質量(g)；Hn：放置后樣品質量(g)。

2.6.2 抗氧化功效研究

其中：A0：鄰苯三酚的自氧化速率；A1：第1 min的OD值；A4：第4 min的OD值。

膠原多肽抑制鄰苯三酚自氧化速率的測定：分別依次加入50 mmol/L、pH=8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.7 mL以及不同濃度的膠原多肽溶液4 mL，于25 ℃水浴鍋中保溫10 min，取出后加入0.3 mL已預熱的鄰苯三酚立即混勻并同上測定OD值并計算自氧化速率ΔA。膠原多肽對超氧離子的清除率計算公式如下：

其中：ΔA0：鄰苯三酚的自氧化速率；ΔA：加入待膠原多肽后鄰苯三酚的自氧化速率。

2.6.2.2 羥基自由基(·OH)清除能力測定

測定方法參考Zhang和Ding等方法[4-6]，具體如下，取10 mL試管依次加入FeSO4(9 mmol/L)l mL、水楊酸-乙醇(9 mmol/L)l mL、不同濃度膠原多肽溶液l mL，混勻后加入8.8 mmol/L H2O2l mL啟動反應，37 ℃水浴加熱反應30 min，以蒸餾水為參照，在510 nm下測量吸光值。以不添加H2O2的溶液為待測溶液的本底吸收值。清除率計算公式如下：

其中：A0：空白對照液的吸光度；Ax：加入膠原多肽后的吸光度；Ax0：不加顯色劑H2O2的待測溶液本底的吸光度。

2.6.2.3 二苯代苦味酰自由基(DPPH)清除能力測定

具體方法[5,7]為，取5 mL離心管加入不同濃度膠原多肽溶液2 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液，混勻避光反應20 min，在517 mn測得吸光值。以乙醇與不同濃度膠原多肽溶液等量混合液為對照管，DPPH溶液與去離子水等量混合后為空白管，清除率計算公式如下所示：

其中：Ax：加入待測樣品后的吸光度；Ax0：待測樣品與乙醇混合液的本底吸光值；A0：DPPH溶液與去離子水等量混合液的吸光值。

2.7 FBCP的皮膚刺激及眼刺激評價

2.7.1 多次皮膚刺激實驗

采用自體對照方式，選擇健康、成年、皮膚無損的白色家兔4只，試驗前24 h用8%硫化鈉將試驗動物背部脊柱兩側背毛去除，去除面積左右各約3 cm×3 cm，將0.5 mL 50%(W/V)雙斑東方鲀魚皮膠原多肽溶液涂抹于一側，另一側作為空白對照，每天涂抹一次，涂抹后清洗觀察皮膚狀態，連續涂抹觀察14天。第二天開始，每次涂抹前剪毛，用水清除殘留受試物。涂抹1 h后觀察結果，根據2015年版《化妝品衛生規范》[8]中皮膚刺激性反應評分標準對實驗結果進行評分，計算給藥動物積分均值，并對照皮膚刺激強度評分表判定皮膚刺激強度。

2.7.2 急性眼刺激試驗

按照《化妝品衛生規范》2015版所示方法[8]進行測定，試驗開始前24 h對受試動物眼睛進行檢查，選用眼睛健康的受試動物，將50%(W/V)雙斑東方鲀魚皮膠原多肽溶液滴入受試動物一只眼睛結膜囊中，使上、下眼瞼被動閉合1 s，另一側眼睛作空白對照對照，30 s后用水安全流速沖洗30 s。滴入受試物后分別l、24、48、72 h以及第4天、第7天對受試動物眼睛進行檢查，根據眼損害的評分標準表記錄受試動物眼刺激反應進行積分，若觀察72 h未出現刺激反應，即可終止試驗。若發現眼刺激作用且7天內不可恢復，則為確定該損害的可逆性或不可逆性，需延長觀察時間。根據受試動物角膜、虹膜或結膜分別在24、48或72 h觀察點的刺激反應的最高積分和恢復時間，根據眼刺激反應分級表確定受試物對眼的刺激強度。

3 結果與討論

3.1 雙斑東方鲀魚皮基本組分分析

雙斑東方鲀魚皮中，膠原蛋白含量占魚皮的23.80%，占粗蛋白的88.08%(表2)。可見膠原蛋白是雙斑東方鲀魚皮的主要蛋白質，具有極高的利用價值，這為提取膠原多肽及研究河鲀魚皮膠原多肽活性提供了研究基礎。Zhang等[9]測定了暗紋東方鲀魚皮基本成分：水分含量75.65%、粗蛋白含量96.53%(干重)、膠原蛋白含量88.50%(干重)，膠原蛋白占總蛋白含量的91.68%。任俊風測定紅鰭東方鲀魚皮基本成分，總蛋白含量97.3%，膠原蛋白含量87.6%，膠原蛋白占總蛋白含量的90%[10]。本研究結果與文獻報道其他品種河鲀魚皮基本成分結果相似，這間接表明了本研究結果的真實可靠性，亦表明雙斑東方鲀魚皮是膠原蛋白的良好來源，也為后續膠原多肽的提取實驗奠定了良好的基礎。

表2 雙斑東方鲀魚皮基本成分

3.2 FBCP提取單因素分析

結果如圖1所示，伴隨溫度的升高，肽得率呈現先增加后下降的趨勢。在45～50 ℃的溫度范圍內，反應溫度的升高促使酶促反應速度加快，能高效酶解河鲀魚皮，當溫度高于50 ℃時膠原多肽得率顯著降低。隨著酶解時間的延長，肽得率逐漸上升，當酶解時間大于4 h時，肽得率無明顯差異。因此初步確定4 h為適宜酶解時間。在pH值為9.0時肽得率達到最高，低于9.0或高于9.0肽得率均有所下降。隨著加酶量增加，肽得率呈現一種先上升后下降的趨勢。酶添加量為8 000 U/g時，肽得率達到最大值，由此選擇8 000 U/g為酶解反應的適宜加酶量。因此，最終選擇溫度50 ℃，酶解4 h，pH9.0，8 000 U/g的加酶量作為正交實驗的基礎。

圖1 酶解條件對肽得率的影響

3.3 FBCP正交試驗分析

通過正交試驗分析，可知該實驗中對肽得率的影響主次順序為溫度>加酶量>酶解pH值>時間(表3)。對正交試驗進行方差分析可知(表4)，溫度、加酶量、酶解pH三因素均達到極顯著水平，酶解時間對肽得率無顯著影響，結合單因素實驗結果和時間成本雙重方面考慮，選擇酶解時間為4 h，因此通過極差分析得出的河鲀魚皮膠原多肽的最佳提取工藝為A2B3D2C2，即料液比1∶10、酶解溫度50 ℃、加酶量8 000 U/g、酶解pH值9.0、酶解時間4 h。采用上述工藝條件進行實驗驗證，三次平行實驗測得的雙斑東方鲀魚皮膠原多肽的提取率分別為39.93%、39.65%、39.37%。

表3 正交實驗分析表

表4 方差分析表

3.4 雙斑東方鲀魚皮膠原多肽在化妝品中的功效性研究

3.4.1 吸濕保濕功效測定

在高濕度環境(RH=70%)和低濕度環境(RH=40%)中，不同試樣的吸濕率都隨時間的推移而逐漸增大(圖2)，說明各試樣均具有良好的吸濕性。吸濕10 h后，甘油的吸濕率最高，其次為FBCP1，分別為4.54%±0.12%(RH=40%)和4.13%±0.08%(RH=70%)，FBCP1的吸濕率均高于其余膠原多肽，且FBCP1的吸濕率在不同濕度環境下變化不顯著。由各試樣的保濕率測定結果可知，在RH為40%和70%環境下，各試樣具有一定的保濕能力。甘油保濕率最高，FBCP各組分中FBCP1較其余膠原多肽同樣具有較好的保濕效率。

圖2 不同濕度條件下吸濕率與保濕率測定

從上述吸濕保濕活性測定結果看出，四種組分中FBCP1具有更優越的吸濕性和保濕性。吸濕性是物質吸附或攝取水分的能力，保濕性是物質保持水分的能力，多肽可通過氨基酸側鏈和蛋白質的肽鍵與水分子間的相互作用，防止水分蒸發，是良好的吸濕和保濕劑[11]。不同多肽分子對水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同[12]。FBCP1分子量小，可能結構上相較于其他三種組分暴露出更多的親水基團(氨基、羧基和羥基等)，對水分子結合力強，吸收水分和保持水分的能力也較大。

3.4.2 抗氧化功效測定

表5 不同膠原多肽及谷胱甘肽自由基清除IC50比較

圖3 FBCP對自由基的清除作用

3.5 雙斑東方鲀魚皮膠原多肽多次皮膚刺激及眼刺激測定

3.5.1 多次皮膚刺激實驗

多次皮膚刺激試驗結果如下表所示，涂抹FBCP溶液14天后，4只受試兔皮膚均未見紅斑和水腫，計算獲得每天每只動物的積分均值為0，因此涂抹50%雙斑東方鲀膠原多肽溶液對皮膚無刺激性。

表6 FBCP皮膚刺激性測定

3.5.2 急性眼刺激實驗

急性眼刺激實驗結果如下表所示，滴入50%(W/V)FBCP溶液后，3只受試兔眼睛的結膜未見充血，角膜未見渾濁異常，虹膜正常，觀察點的刺激反應的最高積分均為0，因此滴入50%雙斑東方鲀膠原多肽溶液對眼無刺激性。

表7 FBCP急性眼刺激測定

本研究通過多次皮膚刺激實驗和急性眼刺激實驗等體內實驗測定FBCP的刺激性，實驗結果均表明FBCP無刺激性。大量研究已證實了魚源水解膠原多肽的無刺激性，Li等[16]開展了羅非魚魚皮膠原多肽復配潤膚霜的安全性研究，實驗結果表明添加羅非魚魚皮膠原多肽的潤膚霜無任何刺激作用，Zhou等[17]研究了口服小分子魚膠原蛋白粉對改善女性面部膚質的有效性和安全性，受試組面部皮膚的細紋、毛孔、紋理、紫質、水份、油脂改善明顯，且無明顯不良反應，具有較好的安全性和有效性。上述實驗均表明魚皮膠原多肽作為護膚品原料的可行性，這為后續研制開發雙斑東方鲀魚皮膠原多肽化妝品奠定了基礎。

4 結論

本研究利用現代酶學技術，通過單因素和正交實驗，確定了制備具有較高肽得率的FBCP的最佳酶解工藝條件：堿性蛋白酶為水解酶，料液比1∶10、酶解溫度50 °C、加酶量8 000 U/g、酶解pH值9.0、酶解時間4 h。本研究提取的FBCP在抗氧化、體內外保濕方面均有顯著效果。研究表明，FBCP1(<1kD)具有最佳的自由基清除能力和保濕吸濕能力。同時，FBCP不具有皮膚刺激性和眼刺激性，作用溫和，這為將來用于化妝品的添加劑提供理論基礎。