靶向探針追蹤A β25-35的亞細胞定位并基于Nrf2通路探討阿里紅多糖對線粒體損傷的保護機制

阿依江·哈拜克，王曉梅，閆 冬，李 敏，帕麗達·阿不力孜

新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊830011

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經退行性疾病，以認知功能障礙為主要臨床表現[1]。對于AD的發病機制目前有諸如氧化應激假說[2]、線粒體損傷學說[3]、Aβ毒性學說等等[4]，并且發現Aβ沉積，神經炎癥的發生，氧化應激都會引起線粒體損傷，最終導致神經元凋亡[5,6]，因此，線粒體損傷通路與多種學說交叉，研究意義至關重要。

阿里紅(FomesoffcininalisAmes，FOAPs)為多孔菌科藥用層孔菌的干燥子實體。阿里紅多糖作為阿里紅主要有效成分之一具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等功效[7,8]。課題組前期將阿里紅多糖經DEAE纖維素-52，Sepharose CL-6B和葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析分離純化得到兩種多糖組分FOAPs-a與FOAPs-b[9]。本課題組一直著力于阿里紅多糖對AD線粒體靶向性治療的研究，發現在Aβ25-35誘導的PC12細胞中，阿里紅多糖給藥組相對于模型組具有顯著改善線粒體損傷的作用，包括ATP含量和線粒體膜電位MMP上升，ROS含量下降，線粒體內細胞色素含量C回升等，表明，阿里紅多糖對AD模型中，線粒體損傷通路和氧化應激損傷均具有一定程度的改善作用，本實驗擬從Aβ25-35與PC12細胞的線粒體熒光共定位角度出發[10-12]，探討阿里紅多糖組分FOAPS-a和FOAPs-b可通過參與Nrf2氧化還原信號通路，從而發揮對PC12細胞線粒體損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠瘤細胞(PC12細胞)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；阿里紅多糖組分(新疆醫科大學藥學院天藥生藥教研室提取自用)；Aβ25-35蛋白(Genscript，南京)；FBS胎牛血清(Hyclone公司)；DMEM高糖培養基(Hyclone，公司)；雙抗(Hyclone 公司)；鹽酸多奈哌齊(Sigma公司)，FAM-Aβ25～35熒光(Genscript，南京)；Cy3標記羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；COXIV(Proteintech,武漢)；ROS檢測試劑盒(碧云天公司)；兔多抗Bcl-2抗體(Genetex公司)、兔多抗Bax抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)、兔多抗Nrf2(Absin，Abs130481)、兔多抗P-ASK1(Absin，Abs131102)、兔多抗ASK1(美國Cell signaling，批號8662)、兔單克隆抗GAPDH抗體(美國Abcam公司，Ab8245)。

1.2 實驗儀器

CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)；SWCJ2F超凈臺(AIRTECH公司)；IX71～12FL/PH 倒置熒光研究級三目顯微鏡(日本Olympus公司)；721BR13868凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；流式細胞儀(FACSAriall，北京Scotsman公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物處理

1.3.1.1 Aβ25-35寡聚體的制備及實驗條件的選擇

稱取藥物Aβ25-351 mg，用471.6 μL溶劑水溶解成濃度為2 mM的母液待用，母液于-20 ℃保存;分裝Aβ25-35母液，在使用前取適量于37 ℃震蕩孵育8天，使多肽聚集。

1.3.1.2 FOAPs-a及FOAPs-b溶液的制備與實驗條件的選擇

采用水提醇沉法提取阿里紅粗多糖，經DEAE纖維素-52，Sepharose CL-6B和葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析對粗多糖進行純化得到均一多糖組分FOAPs-a，FOAPs-b[9]，平均分子量分別為199和87 kDa。用DMEM培養基充分溶解，PC12細胞干預時用不含血清的培養基稀釋到所需濃度。

1.3.2 PC12細胞的培養和分組

按照預實驗確定的給藥及損傷的濃度和時間，取對數生長期的PC12細胞以1× 104個/孔接種至96孔板，在培養箱孵育24 h，待細胞密度長到75%左右時,分為空白組(只加培養液)、模型組(加入40 μmol/L Aβ25-35)、陽性藥物組(50 μmo/L鹽酸多奈哌齊)、高、中、低濃度的 FOAPs-a及FOAPs-b干預組(各50、100、200 μg/mL)等。

1.3.3 細胞爬片免疫熒光單標實驗

1.3.3.1 細胞處理

取處于對數生長期的PC-12細胞，用DMEM培養基調整細胞密度到105個/mL，接入六孔板，每孔2 mL細胞懸液，同時設空白孔，37 ℃培養24 h，棄上清，分正常組(加不含血清的培養基)；模型組(40 μmol/L FAM-Aβ25-35)；給藥組(加入DMEM配置的200 μg/mL FOAPs-a/b應用液處理2 h，再加FAM-40 μmol/L Aβ25-35共同孵育培養48 h。

1.3.3.2 免疫熒光

將細胞玻片用PBS浸洗3 min×3次；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗；0.5% Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min；PBS浸洗，吸水紙吸干，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸干，不洗，滴加足量一抗(稀釋比1∶100)，4 ℃孵育過夜；PBST 浸洗吸干，滴轉移暗處，加熒光二抗(稀釋比1∶100)，37 ℃孵育1 h，PBST浸洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min進行染核，PBST 浸洗5 min×4次，吸水紙吸干，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡采集圖像。

1.3.3 活性氧自由基ROS檢測

收集細胞，按照DCFH-DA細胞ROS檢測試劑盒操作：按照1∶1 000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，體積；棄PBS加入稀釋好的DCFH 1 mL；37℃培養箱孵育20 min，每隔3 min混勻一次；用無血清培養基體積洗滌細胞3次。1 500 rpm，5 min離心，棄上清，加PBS重懸；流式細胞儀機檢測。

1.3.4 Western blotting檢測Bcl-2、Bax、Nrf2、APK1及P-APK1的蛋白表達量

將對數生長期的PC12細胞以(2×105個/孔)接種到6孔板中，分組方法同上。24 h后用預冷的PBS洗三遍，收集細胞離心，并加入適當的RIPA裂解液吹打混勻，在冰上靜止30 min左右，裂解完全后，4 ℃、12 000 rpm離心12 min，取上清即為提總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白濃度，經過煮蛋白、上樣、電泳、轉膜、封閉、孵育一抗：兔多抗Bcl-2抗體(1∶1 000)，兔多抗Bax抗體(1∶1 000)，兔多抗Nrf2(1∶1 000)，兔多抗P-ASK1(1∶ 1 000)，兔多抗ASK1(1∶1 000)，兔單克隆抗GAPDH抗體(1∶1 000)過夜、用1×TBST洗膜三次后，室溫孵育AP標記二抗(1∶1 000)1 h、顯色液顯色，條帶出現后定影終止，對目的蛋白和內參蛋白條帶進行總灰質分析。

1.3.5 統計學處理

2 結果

2.1 熒光探針追蹤A β25-35在線粒體中的表達結果

如圖圖1A和1B：與空白組比較，模型組細胞內紅色熒光強度明顯減弱，且出現較強的綠色熒光,綠色和紅色熒光疊加出現黃色熒光，表明Aβ25-35與線粒體共定位；觀察單個PC12細胞周邊熒光強度，發現紅色熒光強度明顯減弱，表明線粒體的完整性受到影響，細胞核形態畸形；與模型組相比，在200 μg/mL FOAPs-a 和FOAPs-b預處理PC12細胞后，細胞核形態趨于正常，Aβ25-35的綠色熒光強度明顯減弱，紅色熒光強度增強，紅色熒光強度與綠色熒光強度的比值IOD差異有統計學意義(P<0.05，圖1C)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下的熒光共定位結果

2.2 活性氧自由基ROS含量檢測結果

活性氧自由基ROS檢測結果顯示：與空白組比較，模型組細胞中ROS沉積量明顯增加；與模型組比較，各濃度的FOAPs-a及FOAPs-b均能顯著降低ROS的含量，且具有濃度依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)，陽性對照組顯示鹽酸多奈哌齊(DHCL)具有良好的抗Aβ25-35誘導的氧化應激的作用；FOAPs-a和FOAPs-b在濃度50、100和200 μg/mL時，均具有良好的抗氧化應激的作用，但仍未恢復到陽性對照鹽酸多奈哌齊(DHCL)的影響水平(P<0.05,圖2)。

圖2 檢測阿里紅多糖組分對PC12細胞ROS的影響

2.3 Western blotting檢測結果

2.3.1 Bcl-2和Bax蛋白表達結果

如圖3 Western blotting結果顯示：與空白組比較，Aβ25-35誘導的模型組細胞中，Bcl-2蛋白的表達量顯著性下降，而Bax蛋白表達量則明顯增加，即Bcl-2/Bax的相對表達率下降(如圖4所示)，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，不同濃度的FOAPs-a及FOAPs-b均能顯著增加Bcl-2的表達量，同時顯著降低Bax蛋白的表達水平，并具有濃度依賴性，結果表明，FOAPs-a及FOAPs-b可以通過調控細胞凋亡因子對Aβ25-35誘導的PC12細胞發揮抗氧化應激作用，從而起到神經保護作用，且FOAPs-a比FOAPs-b的調控能力更好。

圖3 不同處理組Bcl-2和Bax蛋白表達情況

圖4 不同處理組Bcl-2和Bax蛋白相對表達量(Bcl-2/Bax)統計柱狀圖

2.3.2 Nrf2、ASK1和P-ASK1的表達

為了觀察阿里紅多糖組分保護PC12細胞對抗Aβ25-35引起的氧化應激和線粒體損傷的作用機制可能是ASK1凋亡途徑激活Nrf2信號通路。以50、100、200 μg/mL阿里紅多糖組分FOAPs-a和FOAPs-b對PC12細胞進行干預處理2 h后，再加入40 μmol/L Aβ25-35繼續培養48 h后，用蛋白免疫印跡法檢測細胞中Nrf2和ASK1的蛋白表達水平及ASK1蛋白的去磷酸化程度，結果顯示(圖5)：與空白組比較，40 μmol/L Aβ25-35處理組中細胞凋亡信號調節激酶 1(APK1)蛋白表達量增加，APK1的磷酸化水平升高，Nrf2被激活；與模型組比較，50、100、200 μg/mL的FOAPs-a及100、200 μg/mL FOAPs-b干預后，ASK1蛋白含量顯著下降，ASK1的磷酸化水平也下降,差異具有統計學意義(P<0.05，圖6)，50 μg/mL FOAPs-b干預后，蛋白表達量無統計學意義。與此同時，Nrf2的蛋白表達量顯著增加，且呈現濃度依賴性，表明阿里紅多糖組分FOAPs-a和FOAPs-b可以通過ASK1凋亡途徑激活Nrf2信號通路拮抗Aβ25-35誘導的PC12細胞的氧化應激和線粒體損傷，且高劑量FOAPs-a和FOAPs-b干預可以發揮更強的抗氧化和抗細胞凋亡作用。

圖5 不同處理組Nrf2、ASK1和P-ASK1蛋白表達情況

圖6 不同處理組Nrf2、ASK1和P-ASK1蛋白平均光密度值比值(與GAPDH)統計柱狀圖

3 討論

在生理情況下，線粒體在人體功能正常狀態下，其功能主要是維持ROS的生成和去除處于一個平衡狀態。在病理情況下，ROS不能夠及時被清除，可能導致ROS沉積，這可能與線粒體受損有關[13]。反過來ROS濃度過高，一方面影響了線粒體的正常運轉，促使體內氧化應激反應的大量產生，進而造成神經元損傷，甚至導致患者死亡；另一方面，ROS聚集還會造成Aβ的超量。有學者研究證實Aβ的沉積會直接導致神經元的損傷，而受損的線粒體中產生大量氧化應激反應，促使淀粉樣前體蛋白APP更易分解為不溶性的Aβ。課題組前期研究體內實驗發現，阿里紅提取物對Aβ25-35致癡呆動物模型學習記憶障礙有一定的改善作用[14]，阿里紅多糖組分對APP/PS1雙轉基因小鼠行為學有影響[15]。本研究預實驗結果顯示，相比空白組，用40 μmol/L Aβ25-35誘導的PC12細胞中ROS大量聚集，數量顯著性增多，Aβ25-35打破了ROS的動態平衡，產生了氧化應激相關指標SOD，MDA，LDH的異常，進而出現一系列AD的癥狀，說明Aβ25-35造成PC12細胞的線粒體損傷；然后在這個AD模型中用不同濃度的阿里紅多糖組分FOAPs-a和FOAPs-b給藥后，組內ROS聚集情況得到了顯著的改善，且能顯著增加Bcl-2的表達量，同時顯著降低Bax蛋白的表達水平，各組內呈現濃度依賴性，組間比較后發現FOAPs-a對線粒體功能的改善作用要優于FOAPs-b的效果。同時，熒光探針共定位實驗和WB檢測凋亡蛋白結果進一步證實：Aβ25-35的確可以進入到PC12細胞的線粒體當中，誘導其線粒體的形態和數量發現不同程度的改變，并加速細胞凋亡，而FOAPs-a和FOAPs-b給藥組則可以改善線粒體的損傷程度和抑制細胞的凋亡。

文獻報道，線粒體功能障礙和氧化應激是AD的重要病理特征，過度氧化應激反應會導致氧化還原通路Nrf2的激活。近年來研究發現Nrf2(nuclear related factor 2)是一種重要的核轉錄因子，在細胞抗氧化應激反應中起著很重要的作用[16]。在生理條件下，Nrf2處于惰性狀態，當機體在病理條件下，Nrf2被激活與抗氧化反應元件(antioxidant responseelement，ARE)結合，從而啟動一系列的抗氧化物質的合成來對抗氧化應激[17]；另外，Nrf2誘導產生的血紅素加氧酶(HO-1)具有神經保護作用，HO-1催化血紅素生成的產物亦是體內強有力的ROS清除劑，對Aβ誘導的細胞毒性發揮重要的神經保護作用[18]，過表達Nrf2的神經元能夠減輕Aβ毒性損傷，上調Nrf2目標基因的表達從而減少氧化應激的發生[19]。細胞凋亡信號調節激酶 1(ASK1)是高度保守的MAP3Ks 家族成員之一，ASK1被激活后能夠將MKK3/MKK6-p38和MKK4/MKK7-JNK兩大激酶通路激活，最終誘導細胞發生凋亡[20]。研究發現很多調控因子與ASK1直接結合調控其活性，ASK1去磷酸化則活化,從而導致細胞凋亡發生[21]。本實驗中WB結果顯示：與模型組比較FOAPs-a及FOAPs-b均能減少APK1的磷酸化和上調Nrf2的蛋白表達，說明兩種阿里紅多糖組分FOAPs-a和FOAPs-b均能夠激活Nrf2蛋白的表達，參與氧化還原信號通路，對抗AD中的氧化應激反應，在一定程度上改善線粒體損傷進而緩解氧化應激損傷，揭示阿里紅多糖線粒體保護作用的分子機制。

綜上所述，阿里紅多糖組分可抑制Aβ25-35誘導PC12細胞的線粒體損傷和細胞凋亡的產生，對AD模型的線粒體損傷通路和氧化應激損傷均具有一定程度的改善作用，推測阿里紅多糖可能參與氧化應激損傷通路，發揮對線粒體的保護作用，但其詳細的機制仍需深入研究。