雷公藤甲素對變應性鼻炎大鼠鼻粘膜組織TGF-β1、IL-4表達的影響

陳 霞，鐘 勛，梁 卉，張曉萍，周 敏

（1.萍鄉衛生職業學院，江西 萍鄉 337000；2.湘雅萍礦合作醫院，江西 萍鄉 337000）

變應性鼻炎（Allergic Rhinitis， AR）是一種多基因遺傳和多環境因素共同影響的鼻變態反應性疾病，患病率為10～20%，主要表現為鼻塞、流清水涕、噴嚏、鼻癢，嚴重影響患者生活質量。AR發病機制由多種細胞因子、炎癥細胞、信號通路以及炎性介質等共同參與。中醫藥在治療變應性鼻炎已取得研究成果[1]，雷公藤有激素樣作用但又無激素的不良反應，其作用與轉化生長因子密切相關，已用于哮喘的治療研究，但應用于AR的研究及作用機制不明確。因此研究TGF-β1、白介素4（IL-4）在雷公藤對AR的作用機制可探索新的治療應用，為臨床提供新視角。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

卵清蛋白購自美國Sigma公司。雷公藤甲素購自維克奇生物公司。蛋白提取試劑盒購自上海科研生物科技有限公司。實驗大鼠按國家相關要求進行飼養。光學顯微鏡（上海光學37-XB），高靈敏度熒光成像系統（Bio-Rad，上海）。

1.2 建立大鼠模型

將大鼠隨機分為四組，每組10只:卵清蛋白（OVA）致敏組-模型對照組，雷公藤甲素（TP）處理組-藥物處理組，氯雷他定（IR）處理組-陽性對照組，和生理鹽水（SC）組-空白對照組。采用OVA基礎致敏法：以OVA混懸液灌腸，隔日1次，共14天。局部致敏：第15天始，TP組和IR組以OVA+生理鹽水滴注鼻腔予局部激發，1次/天，連續10天，同時，分別以雷公藤甲素和氯雷他定灌胃，1次/天。SC組和OVA組以生理鹽水滴鼻，1次/天，且等量生理鹽水灌胃，連續10天。

1.3 癥狀評分

鼻分泌物流至前鼻孔處，噴嚏次數1～3個且輕撓鼻部，記1分；鼻分泌物流至滿面，噴嚏次數大于11個且劇烈撓鼻面部，記3分；介于二者之間記2分。

1.4 標本采集與制備

心臟放血法將大鼠處死，取游離雙側鼻粘膜組織，置于40 g/L多聚甲醛固定4～6小時，常規石蠟包埋，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察嗜酸性粒細胞計數，每張切片觀察5個高倍視野，取其平均值。

1.5 Weston-Blot法檢測鼻粘膜組織中TGF-β1，IL-4蛋白表達水平

按試劑盒說明進行蛋白提取，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白變性，制備好的蛋白樣品加入10%的凝膠中行SDS-PAGE電泳，轉膜，取膜，脫脂牛奶封閉，一抗（1:500）4℃孵育過夜，PBS液洗膜3次；孵育二抗（1:300），PBS洗膜3次，顯色曝光后凝膠成像系統分析結果。

1.6 統計學處理

采用SPSS 11.0軟件對數據進行處理，實驗前后癥狀學比較采用t檢驗，組間比較采用方差分析，實驗數據以±s表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 癥狀學觀察

除SC組外，造模后各組小鼠均出現不同程度變應性癥狀，評分均大于5分，見表1，各組分別與SC組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；但TP組和IR組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 干預治療前后癥狀評分

2.2 各組鼻粘膜組織病理學觀察

OVA組：鼻粘膜組織明顯腫脹，增厚，毛細血管擴張，杯狀細胞增多，大量嗜酸粒細胞及炎性細胞浸潤。TP組：鼻粘膜輕度腫脹，毛細血管未見明顯擴張，少量嗜酸性粒細胞及炎性細胞浸潤。IR組：病理表現與處理TP組相似。SC組：未見明顯異常。

2.3 各組鼻粘膜組織中TGF-β1、IL-4的表達

與SC組比較，OVA組TGF-β1和IL-4含量較高，有統計學意義（P＜0.05）；與OVA組比，IR組和TP組中TGF-β1和IL-4含量均較低，有統計學意義（P＜0.05）。TP組TGF-β1和IL-4含量稍低于IR組，但無統計學意義（P＞0.05）

3 討 論

AR是由多種物質共同參與的慢性氣道炎癥，具有典型的臨床表現和病理學改變。本實驗結果OVA組符合典型AR的改變，而TP和IR組經干預后變應性癥狀及病理學變化明顯改善。表明雷公藤甲素干預作用與氯雷他的治療定效果相當。IL-4，IL-5等炎癥細胞因子可誘導嗜酸性粒細胞的產生、聚集、活化、脫顆粒，輔助B細胞產生IgE等介導體液免疫應答及變態反應，從而產生鼻粘膜炎癥。本實驗結果表明OVA組嗜酸性粒細胞和IL-4表達水平較IR組明顯升高，而TP組較IR組明顯降低，OVA組大鼠的變態反應癥狀學得分較IR組明顯升高，TP組較IR組得分明顯降低，三者綜合表明雷公藤甲素可降低IL-4的發生，抑制嗜酸性粒細胞的生成，從而減輕粘膜細胞腫脹，減輕毛細血管擴張，最終減輕或抑制鼻腔粘膜細胞的變態反應作用。

TGF-β1是一種多功能細胞調節因子，對人體免疫起調節作用，中藥可通過局部的信號通路調節抑制TGF-β1的生成，從而減輕氣道重塑。雷公藤類藥物具有廣泛的免疫抑制和激素樣作用，但無激素樣副作用，已成功應用于支氣管哮喘的臨床治療研究[2]，本實驗結果表明，雷公藤甲素可顯著抑制TGF-β1的表達及嗜酸性粒細胞等炎性細胞產生，減輕鼻粘膜組織的腫脹，減輕鼻變態反應癥狀，與氯雷他定相比，同樣可以改善AR。眾多研究表明，呼吸道粘膜的氣道反應是通過TGF-β1信號通路來實現的，因此，雷公藤甲素可通過抑制IL-4的生成，局部鼻粘膜的TGF-β1低表達，嗜酸性粒細胞浸潤減少，從而使鼻粘膜細胞的腫脹減輕，癥狀得到緩解，這可能是雷公藤甲素抑制鼻變態反應的重要機制，可為雷公藤于臨床治療AR提供新思路，但如何調節TGF-β1的表達仍需進一步研究。