農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)試材使用現(xiàn)狀及管理建議

袁善奎，單煒力，周艷明，周欣欣，陳 朗

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

自2014年GB/T 31270《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》系列國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1]發(fā)布以來(lái)，我國(guó)農(nóng)藥環(huán)境安全性測(cè)試相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法每年均以10項(xiàng)左右的速度增長(zhǎng)。截止2019年9月，已制定用于農(nóng)藥登記的環(huán)境安全性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)47項(xiàng)，其中：環(huán)境歸趨類(lèi)15項(xiàng)、生態(tài)毒理學(xué)類(lèi)32項(xiàng)，已初步形成較為完善的標(biāo)準(zhǔn)方法體系，基本覆蓋現(xiàn)行《農(nóng)藥登記資料要求》[2]中的農(nóng)藥環(huán)境影響試驗(yàn)項(xiàng)目，成為農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系的重要技術(shù)支撐。不同類(lèi)型的環(huán)境生物及土壤試材是農(nóng)藥環(huán)境影響試驗(yàn)中的基本試材。生物試材及土壤試材的質(zhì)量是獲得科學(xué)、可靠試驗(yàn)數(shù)據(jù)的重要因素。不同實(shí)驗(yàn)室間試驗(yàn)試材的來(lái)源、飼育與培養(yǎng)設(shè)施、培養(yǎng)方法與環(huán)境等是否一致關(guān)系著數(shù)據(jù)的可重復(fù)性與可比性。歐洲實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)聯(lián)合會(huì)于2007年專(zhuān)門(mén)發(fā)布了針對(duì)用于標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試和其他科學(xué)研究目的的動(dòng)物飼育管理指南[3]。我國(guó)目前在農(nóng)藥環(huán)境影響試驗(yàn)試材管理方面尚處于起步階段。

本文歸納總結(jié)了國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥環(huán)境影響試驗(yàn)準(zhǔn)則中對(duì)試驗(yàn)試材的要求，并針對(duì)我國(guó)農(nóng)藥登記環(huán)境影響資料要求涉及的土壤試材和11類(lèi)生物試材在國(guó)內(nèi)各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的使用情況進(jìn)行了調(diào)研，旨在分析農(nóng)藥環(huán)境影響試驗(yàn)試材使用中存在的問(wèn)題并提出解決方案，進(jìn)一步提高生物試材和土壤試材的規(guī)范化水平，提高農(nóng)藥環(huán)境影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

1 國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥環(huán)境影響試驗(yàn)試材基本要求

1.1 生物試材及其規(guī)范化要求 現(xiàn)行《農(nóng)藥登記資料要求》[3]中，生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)資料涉及鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蜜蜂、家蠶、大型溞、綠藻、蚯蚓、赤眼蜂、瓢蟲(chóng)、浮萍、穗狀狐尾藻等11個(gè)生物類(lèi)型。在測(cè)試生物數(shù)量方面，由于現(xiàn)階段生態(tài)保護(hù)目標(biāo)的差異，我國(guó)要求測(cè)試的生物類(lèi)型及測(cè)試物種均少于美國(guó)[4]及歐盟[5]的要求，比如暫未規(guī)定對(duì)底棲生物、海洋生物影響的資料要求，對(duì)魚(yú)類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)的測(cè)試種類(lèi)數(shù)量也相對(duì)較少。在測(cè)試物種方面，除中國(guó)特有生物物種(如家蠶)和部分天敵生物(如赤眼蜂)，魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、蜜蜂、蚯蚓、大型溞、綠藻等試材在物種方面國(guó)內(nèi)外要求基本一致。

客觀上，由于生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)涉及的生物試材種類(lèi)多、個(gè)體小、繁殖快、部分品種貯存與運(yùn)輸困難，在規(guī)范化管理方面不易像毒理試驗(yàn)中類(lèi)似小白鼠等試驗(yàn)動(dòng)物這樣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化管理。為了提高試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性、可比性和重復(fù)性，試驗(yàn)準(zhǔn)則中[1，6]通常對(duì)試驗(yàn)生物的健康狀況、體重、體長(zhǎng)、雌雄比例(如鵪鶉)、生長(zhǎng)季節(jié)(如蜜蜂)以及培養(yǎng)條件等進(jìn)行規(guī)定。生物試材健康狀況良好，前述指標(biāo)在相關(guān)試驗(yàn)準(zhǔn)則規(guī)定的范圍之內(nèi)，則理論上認(rèn)為其合乎要求。此外，OECD和國(guó)內(nèi)的試驗(yàn)準(zhǔn)則[1，6]大多還規(guī)定了周期性參比物試驗(yàn)作為質(zhì)控要求。例如，以重鉻酸鉀作為參比物，要求其對(duì)斑馬魚(yú)24h急性毒性L(fǎng)C50在200～400 mg/L之間，對(duì)大型溞24h急性毒性EC50在0.6～2.1 mg/L之間；以樂(lè)果作為參比物，其對(duì)蜜蜂48h急性經(jīng)口毒性L(fǎng)D50應(yīng)在0.20～0.30 μg/蜂之間，48h急性接觸毒性L(fǎng)D50應(yīng)在0.20～0.35 μg/蜂之間，0.2 g/ha施用量條件下對(duì)七星瓢蟲(chóng)的急性致死率應(yīng)在40%～80%之間；以氯乙酰胺為參比物，對(duì)蚯蚓的14d急性毒性L(fǎng)C50應(yīng)在20～80 mg a.i./kg干土范圍內(nèi)。除上述試驗(yàn)項(xiàng)目外，目前尚有10余個(gè)生態(tài)毒理試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)未推薦參比物，或未明確參比物的毒性終點(diǎn)范圍。國(guó)內(nèi)制定的意大利蜜蜂幼蟲(chóng)發(fā)育試驗(yàn)準(zhǔn)則中，推薦了樂(lè)果和苯氧威作為參比物，家蠶試驗(yàn)也推薦了樂(lè)果作為參比物，但未給出可參考的參比物毒性范圍。

1.2 土壤試材及其規(guī)范化要求 OECD系列試驗(yàn)準(zhǔn)則[6]中，土壤降解試驗(yàn)要求土壤質(zhì)地為砂質(zhì)壤土、粉壤土、壤土或壤質(zhì)砂土；pH范圍為5.5～8.0；土壤有機(jī)碳含量為0.5%～2.5%；微生物量>總有機(jī)碳的1%。土壤吸附和土壤淋溶試驗(yàn)對(duì)土壤的要求(表1、表2)。土壤表面光解試驗(yàn)(草案)要求使用粉壤土或粘壤土。歐盟農(nóng)藥原藥資料要求(EC 283/2013)[5]中規(guī)定:用于降解、吸附/解吸附或遷移研究的供試土壤應(yīng)具有代表性，在有機(jī)碳含量、粒徑分布和pH方面具有一定差異；當(dāng)降解或遷移可能與pH有關(guān)時(shí)，供試土壤應(yīng)涵蓋特定的pH范圍(5～6、6～7、7～8)。

表1 OECD土壤吸附試驗(yàn)準(zhǔn)則對(duì)土壤的要求[6]

表2 OECD土壤淋溶試驗(yàn)準(zhǔn)則對(duì)土壤的要求[6]

美國(guó)EPA制定的環(huán)境歸趨試驗(yàn)報(bào)告評(píng)審指南[7]中規(guī)定：土壤代謝試驗(yàn)應(yīng)使用4種能代表農(nóng)藥使用區(qū)域的土壤，有機(jī)碳含量、pH、粘粒含量和微生物量應(yīng)有一定差異。土壤吸附試驗(yàn)至少使用5種農(nóng)藥使用區(qū)域的代表性土壤或沉積物。其中一種土壤的有機(jī)質(zhì)含量低于1%。

我國(guó)現(xiàn)行《農(nóng)藥登記資料要求》[2]中，土壤好氧代謝、厭氧代謝、表面光解、吸附、淋溶試驗(yàn)，以及農(nóng)藥在土壤中的分析方法與驗(yàn)證等6項(xiàng)環(huán)境歸趨測(cè)試以及土壤微生物毒性測(cè)試需要使用土壤試材。根據(jù)GB/T 31270[1]，土壤降解試驗(yàn)、表面光解試驗(yàn)、吸附試驗(yàn)、淋溶試驗(yàn)和微生物毒性試驗(yàn)等5個(gè)試驗(yàn)均要求使用天然土壤，推薦使用紅壤土、水稻土、黑土、潮土、褐土等5類(lèi)土壤。具體土壤類(lèi)型及其理化性質(zhì)要求(表3)。

表3 我國(guó)農(nóng)藥登記環(huán)境歸趨試驗(yàn)準(zhǔn)則對(duì)土壤的要求[1]

總體而言，有機(jī)碳含量、pH、粘粒含量和微生物量等4個(gè)土壤參數(shù)是影響試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的重要因素，但由于微生物量的控制較難，國(guó)外的試驗(yàn)準(zhǔn)則主要基于前3個(gè)因素進(jìn)行規(guī)定，并要求試驗(yàn)選擇的不同類(lèi)型的土壤應(yīng)體現(xiàn)這3個(gè)因素的差異。歸納起來(lái)，OECD準(zhǔn)則中上述因素的取值范圍為：pH，(<4.0)～(>7.5)；有機(jī)質(zhì)含量，(<0.5%)～(>10%)；粘粒含量，(<10%)～ 80%。

2 我國(guó)農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)試材使用現(xiàn)狀

2.1 生物試材 我國(guó)農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)中常用的生物試材有11類(lèi)25種[2]。對(duì)25家實(shí)驗(yàn)室的問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果表明，除鳥(niǎo)類(lèi)(日本鵪鶉)、蜜蜂(意大利蜜蜂)、溞類(lèi)(大型溞)、穗狀狐尾藻、蚯蚓(赤子愛(ài)勝蚓)、捕食性天敵(七星瓢蟲(chóng))采用統(tǒng)一物種外，其他生物類(lèi)別各實(shí)驗(yàn)室采用的物種均有所不同。其中，魚(yú)類(lèi)主要采用斑馬魚(yú)，占90%以上，其他測(cè)試物種包括鯉魚(yú)、虹鱒魚(yú)、稀有鮈鯽、日本青鳉等；淡水綠藻主要采用羊角月牙藻，其次為斜生柵列藻，少數(shù)使用普通小球藻；浮萍主要采用紫背浮萍(占64%)，其次是小浮萍，個(gè)別采用圓瘤浮萍；家蠶以菁松×皓月蠶種為主(占67%)，部分實(shí)驗(yàn)室采用了春蕾×鎮(zhèn)珠、蘇菊×明虎等其他具有代表性的蠶種；寄生性天敵主要采用玉米螟赤眼蜂(占74%)，少數(shù)采用松毛蟲(chóng)赤眼蜂、擬澳洲赤眼蜂、舟螟赤眼蜂、螟黃赤眼蜂等。

各實(shí)驗(yàn)室試材來(lái)源渠道差異也較大，導(dǎo)致生物試材的生物學(xué)背景信息相差較大。大型溞、綠藻、浮萍、穗狀狐尾藻、蜜蜂、蚯蚓、瓢蟲(chóng)、赤眼蜂及少數(shù)實(shí)驗(yàn)室的斑馬魚(yú)等主要是通過(guò)外部引種后在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自行擴(kuò)繁；鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、家蠶等繁殖周期相對(duì)較長(zhǎng)的試材通常為直接購(gòu)買(mǎi)，驗(yàn)收合格后用于試驗(yàn)。具備資質(zhì)的專(zhuān)業(yè)的試材提供機(jī)構(gòu)通常能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)室出具試材品系證書(shū)，并提供詳細(xì)的培養(yǎng)過(guò)程，例如，中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻類(lèi)庫(kù)。科研單位或大型養(yǎng)殖機(jī)構(gòu)所提供的試材品種信息較為可靠，但無(wú)法提供品系證書(shū)，這是目前大多數(shù)外購(gòu)試材的供應(yīng)渠道，例如，從中國(guó)農(nóng)科院植保所購(gòu)買(mǎi)赤眼蜂和瓢蟲(chóng)卵卡等。而從市場(chǎng)或者網(wǎng)絡(luò)購(gòu)買(mǎi)的試材則生物學(xué)信息可靠性較差，例如，部分單位從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)觀賞斑馬魚(yú)用于試驗(yàn)、從天貓商城購(gòu)買(mǎi)七星瓢蟲(chóng)卵卡用于試驗(yàn)。還有部分實(shí)驗(yàn)室直接從野外采集試材，例如穗狀狐尾藻、瓢蟲(chóng)、浮萍等，經(jīng)純化后在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)繁和試驗(yàn)。此外，還存在實(shí)驗(yàn)室之間相互提供試材的情況，例如大型溞、綠藻、瓢蟲(chóng)等。

生物試材的價(jià)格也在一定程度上反映了試材的質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)的生物試材價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于市場(chǎng)上普通流通的試材，但不同地區(qū)、不同供貨機(jī)構(gòu)的價(jià)格客觀上也存在差異。

2.2 土壤試材 GB/T 31270[1]規(guī)定的紅壤、水稻土、黑土、潮土、褐土均屬于《中國(guó)土種志》[8]中耕型面積排前十的土類(lèi)目前，國(guó)內(nèi)環(huán)境歸趨實(shí)驗(yàn)室所采用的土壤試材基本都是實(shí)驗(yàn)室間相互提供或委托其他單位采集，并委托專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)或自行進(jìn)行理化參數(shù)測(cè)定。

3 試材規(guī)范化管理中存在的問(wèn)題

3.1 生物試材 首先，大多數(shù)生物試材遺傳背景不清楚。從調(diào)查情況來(lái)看，各實(shí)驗(yàn)室的生物試材來(lái)源渠道多樣化，僅少數(shù)生物試材有相關(guān)證書(shū)。這可能導(dǎo)致試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比性和可重復(fù)性較差。例如，部分市場(chǎng)上的斑馬魚(yú)品種可能是為了增強(qiáng)觀賞價(jià)值而改造的雜交品種。

其次，一部分生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)尚未建立參比物測(cè)試方法。目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)行生態(tài)毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則中僅有9個(gè)試驗(yàn)推薦了參比物及其毒性終點(diǎn)范圍。其余試驗(yàn)尚未建立參比物試驗(yàn)方法，或推薦了參比物但缺少可參考的毒性終點(diǎn)范圍，從而無(wú)法對(duì)生物試材的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)。

再次，缺少統(tǒng)一的生物試材培養(yǎng)方法指南。雖然現(xiàn)有的生態(tài)毒理學(xué)測(cè)試準(zhǔn)則中分別描述了各自使用的生物試材培養(yǎng)條件，但對(duì)培養(yǎng)的具體細(xì)節(jié)，尤其是對(duì)試材的健康檢驗(yàn)檢查方面規(guī)定較少，客觀上造成了生物試材在不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的馴養(yǎng)條件差異較大，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)室間毒性測(cè)試結(jié)果的可比性。

最后，對(duì)本土物種方面的研究和探索仍有待加強(qiáng)。從國(guó)內(nèi)現(xiàn)有試驗(yàn)準(zhǔn)則和調(diào)研情況來(lái)看，雖然測(cè)試的生物物種與OECD準(zhǔn)則一致有利于未來(lái)推進(jìn)政府間的數(shù)據(jù)互認(rèn)，但進(jìn)行農(nóng)藥高級(jí)階段的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估過(guò)程中，例如開(kāi)展物種敏感性分布(SSD)測(cè)試時(shí)，應(yīng)增加本土物種的測(cè)試，以進(jìn)一步明確農(nóng)藥在我國(guó)特定環(huán)境和場(chǎng)景下使用時(shí)的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)。但是，從各實(shí)驗(yàn)室目前飼養(yǎng)的生物試材種類(lèi)來(lái)看，本土物種的儲(chǔ)備較少，不利于開(kāi)展該類(lèi)試驗(yàn)。

3.2 土壤試材 首先，土壤類(lèi)型缺少權(quán)威鑒定機(jī)構(gòu)。GB/T 31270[1]推薦的土壤是按GB/T 17296《中國(guó)土壤分類(lèi)與代碼》[9]中的土類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)，目前尚無(wú)可出具檢測(cè)報(bào)告的有資質(zhì)單位，主要依靠專(zhuān)家個(gè)人經(jīng)驗(yàn)判斷。其次，現(xiàn)有準(zhǔn)則未對(duì)土壤的機(jī)械組成指標(biāo)進(jìn)行規(guī)定。按GB/T 17296[9]，同一土類(lèi)中又分為若干亞類(lèi)、土屬、土種，其土壤理化性質(zhì)會(huì)有差異。例如，不同成土母質(zhì)的紅壤的機(jī)械組成會(huì)存在顯著差異，而GB/T 31270[1]僅規(guī)定了土壤有機(jī)質(zhì)含量和pH，未規(guī)定土壤機(jī)械組成方面的要求。最后， GB/T 31270[1]中對(duì)土壤的個(gè)別指標(biāo)規(guī)定與我國(guó)典型土壤實(shí)際指標(biāo)不一致(例如，規(guī)定黑土有機(jī)質(zhì)含量為2%～3%，而黑土實(shí)際中有機(jī)質(zhì)含量一般均高于3%)，造成實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中很難獲得在土壤類(lèi)型和理化性質(zhì)參數(shù)方面均滿(mǎn)足準(zhǔn)則要求的樣品，導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室土壤樣品使用隨意、試驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性差。此外，土壤理化參數(shù)的差異變化范圍太窄，不能全面反映不同pH和有機(jī)質(zhì)含量對(duì)農(nóng)藥環(huán)境歸趨行為的影響。

4 解決措施和建議

首先，應(yīng)規(guī)范或統(tǒng)一試材來(lái)源渠道。一是對(duì)各農(nóng)藥登記環(huán)境影響實(shí)驗(yàn)室的生物試材引種提出遺傳背景方面的規(guī)范化要求；二是可行時(shí)，針對(duì)部分試材建立統(tǒng)一的供應(yīng)渠道，由有資質(zhì)的試材供應(yīng)單位提供試材，例如土壤試材，選擇符合要求的采樣位點(diǎn)作為固定地點(diǎn)，統(tǒng)一采樣供應(yīng)給實(shí)驗(yàn)室，并提供理化參數(shù)證明。

其次，加強(qiáng)試驗(yàn)試材的規(guī)范化研究。一是加快部分生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)的參比物測(cè)試方法研究，確定參比物種類(lèi)及其毒性終點(diǎn)參考范圍；二是豐富測(cè)試物種，加強(qiáng)對(duì)底棲生物、海洋生物等的敏感性、試材培養(yǎng)與規(guī)范化研究，并積極探索典型本土物種的規(guī)范化飼養(yǎng)。

最后，繼續(xù)完善農(nóng)藥環(huán)境影響試驗(yàn)方法體系。一是修訂現(xiàn)有試驗(yàn)準(zhǔn)則，完善參比物試驗(yàn)要求，參考國(guó)外經(jīng)驗(yàn)修改土壤參數(shù)要求(僅要求所選擇的土壤能代表生產(chǎn)上的主要土壤類(lèi)型，體現(xiàn)不同土壤在有機(jī)碳含量、pH、粘粒含量等參數(shù)方面的差異，而不應(yīng)將土壤類(lèi)型與具體參數(shù)值相關(guān)聯(lián))等；二是加快制定生物試材規(guī)范化飼養(yǎng)與管理標(biāo)準(zhǔn)；三是必要時(shí)，針對(duì)新的保護(hù)物種(包括本土生物)，開(kāi)發(fā)與建立標(biāo)準(zhǔn)化的毒性測(cè)試方法。