六倍體小麥CBS基因家族全基因組分析

郭富燁，蒼 晶，盧秋巍，田 宇，宋春華，任志鵬，孫仙澤，樊曉培，王多佳，付連雙

(1.東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.東北農業大學農學院，黑龍江哈爾濱 150030)

普通小麥(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的農作物之一。由于自身異源六倍體(2n=6x=42，AABBDD)的特殊性，擁有著龐大而復雜的基因組，直到2018年其全基因組序列才全部公布[11]。普通小麥是通過培育的四倍體小麥(2n=4x=28，AABB)與二倍體節節麥(2n=14，DD)雜交獲得[12]。因為普通小麥具有異源六倍體的特殊性，所以是進化研究的珍貴材料。本研究對普通小麥的CBS基因進行了全基因組分析，了解小麥CBS基因的特征，以期為研究小麥CBS基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 小麥CBS基因家族成員的鑒定

首先，在水稻基因組數據庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中找到CBS蛋白，作為對本地BLASTP程序的Queries(E value ≤1e-5)。利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)[13]和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)[14]驗證CBS結構域是否存在。使用InterProScan程序[15]手動確認模糊序列，最后刪除冗余的序列，根據它們結構域信息以及在基因組的位置進行命名。

1.2 小麥CBS結構域蛋白系統發育樹的構建

使用Cluster X(v2.0)生成多序列比對[16]。使用MEGA 7.0軟件[17]的最大似然法(ML)構建無根系統發育樹，bootstrap設置為1000。通過在線網站(https://itol.embl.de/)對系統發育樹進行美化[18]。

1.3 小麥CBS基因結構分析以及CBS蛋白保守功能基序預測

從小麥基因組序列文件(GFF3格式)中提取CBS基因的基因組信息和編碼序列，并分析CBS基因的外顯子/內含子結構。利用MEME(http://me-me-suite.org/)預測CBS蛋白序列的保守基序，重復設定為zero or one，最佳寬度為6～50個氨基酸殘基，最大基序數為10。利用MCScanX[19]對小麥進行共線性分析，刪除重復基因對數≤30的共線性區域以及基因對間相對位置<2×106bp的影響，用TBtools進行可視化[20]和表達譜的繪制。

1.4 小麥CBS基因家族在低溫脅迫下的表達模式分析

從SRA數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov//sra/?term=SRP043554)[21]以及實驗室高通量測序獲取轉錄組數據。實驗樣品為強抗寒性冬小麥品種東農冬麥1號(Dn1)(東北農業大學農學院小麥育種實驗室付連雙老師提供)，2015年9月10日播種于東北農業大學試驗田，行長2 m，行距0.2 m，10行區。播種量450 粒·m-2，播深5 cm，常規田間管理；在大田自然降溫連續10 d平均最低溫度降至 5 ℃、-10 ℃和-25 ℃時，剪取分蘗節用于測定。實驗室前期已經證明Dn1具有抗極低溫的能力，與葉片相比，分蘗節受到的損害較小，是抗寒的重要器官[22]。

2 結果與分析

2.1 小麥CBS基因家族的鑒定結果及蛋白質的基本理化性質

根據水稻基因組數據庫中CBS蛋白序列，通過BLASTP搜索小麥蛋白質數據庫(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository)，比對并鑒定CBS候選基因。進一步利用NCBI以及Pfam檢驗CBS候選基因是否含有完整的結構域，并刪除不具有CBS保守結構域的序列。去除冗余序列后在小麥中共鑒定出136個CBS基因，并根據基因在染色體上的位置命名(表1)。

表1 小麥中CBS基因家族

2.2 CBS基因家族的進化分析

為了解小麥CBS基因家族成員的系統進化關系，使用ML構建系統發育樹，可見CBS基因可分為8個亞家族(A、B、C、D、E、F、G、H)(圖1)，每個亞家族都有明顯的特征。A組僅有3個CBS基因，它們包含一個五肽重復序列(pentatricopeptide repeat，PPR)和CBS結構域；B組有35個CBS基因，它們由一個氯化物通道蛋白(chloride channel，CLC)和CBS結構域構成(TaCBS-CLC-9B-2上并沒有發現CLC結構域)；C組有3個CBS基因，它們由一個肌苷5'-單磷酸脫氫酶(inosine-5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH)構成，且CBS結構域位于IMPDH結構域中；D組可分為兩個亞組D1、D2：D1組有21個CBS基因，它們僅含有一個CBS結構域，D2組含有15個CBS基因，它們由未知功能的DUF21結構域和一個CBS結構域組成；E組有3個CBS基因，由糖異構酶(sugar isomerase，SIS)結構域和一個CBS結構域組成；F組有29個CBS基因，它們中存在1～2個CBS結構域；G組含有6個CBS基因，該組基因由兩個CBS結構域和一個AMP激活的蛋白激酶的糖原識別位點結構域(AMPK1_CBM)組成；H組有21個CBS基因，它們由兩個CBS結構域和一個Phox/Bemp1(PB1)結構域(TaCBSD-PB1-3A-3，TaCBSD-PB1-3B-2僅含有一個CBS和一個PB1結構域)。

圖1 使用最大似然法建立小麥CBS系統發育樹

2.3 CBS基因家族基因結構及蛋白質保守基序分析

小麥是異源六倍體，所以在其基因組上，絕大多數的基因都具有三個高度同源的基因，我們稱之為三聯體。通過進化樹分析發現，CBS基因并不都是三聯體。對他們的蛋白序列以及motif分析發現，所有的CBS蛋白結構域中保守的motif1(圖2)。進化樹同一分支上的基因結構相似，例如D1組含有的保守motif較少，大多數只含有motif1和motif9。相比之下，B組含有較多的保守motif，其中最多含有9個，大多數含有motif 1～7和motif9～10(TaCBS-CLC-9B-2只有一個CBS結構域，可能是因為其測序結果的質量影響，且注釋不完全)，他們可能是CBS結構域中特有的保守motif。通過保守基序分析發現三聯體有著相似的 結構。

內含子、外顯子的結構、內含子類型與數量是一個基因家族典型的進化印跡。小麥三聯體之間的內含子與外顯子數量相近且結構組成相似(圖2)，如F組的內含子均少于6個，H組的內含子均多于10個，且結構域都明顯被內含子分割，并且幾乎所有的內含子都存在于編碼區，僅有少數基因的內含子存在于非翻譯區(UTR)。

圖2 小麥CBS保守基序(左)與基因結構(右)的鑒定

2.4 小麥CBS基因家族在染色體上的分布與重復

為了探究CBS基因在小麥中的進化機制，本研究將CBS基因定位到染色體上。共定位了134個CBS基因(有2個未定位)，3號染色體上的CBS基因最多，其中3A和3B染色體上擁有11個CBS基因，3D染色體有10個CBS基因；1號染色體上的CBS基因最少，1A、1B、1D每條染色體上均只有2個CBS基因。在4A、4B和4D染色體上分別有5、5和6個CBS基因，5A、5B和5D染色體上分別有9、10和9個CBS基因。本研究還發現了兩個未定位的CBS基因，與7號染色體上TaCBS-11s在進化上相似。隨后檢驗了基因家族的復制事件(圖3)，共發現40對CBS三聯體，其中32對具有共線性，但是TraesCS6B 02G264200未被找到，經預測其功能是未知的，沒有保守結構域，但與TaCBS-9s擁有共線性。可能是其本身是CBS基因，但在進化過程中突變導致自身功能消失。除三聯體外，在小麥染色體上還有不成三聯體的CBS基因，可能是本身不存在片段重復或者是小麥在進化過程中發生了串聯重復所致。

該線表示具有同線性，不同的顏色表示不同的鏈接組。A染色體-B染色體是紅線，A染色體-D染色體是藍線，B染色體-D染色體是綠線。

2.5 小麥CBS基因對低溫脅迫的響應

根據已經發表的轉錄組文獻[21]，提取了CBS家族的TPM(transcripts per million reads)值，利用系統發育樹來分析小麥CBS家族的表達模式。發現在低溫脅迫(4 ℃)下，葉片中大部分CBS基因的表達并沒有明顯變化，只有TaCBS-10B和TaCBS-5s響應4 ℃的低溫脅迫(圖4)。參考本實驗室前期凍害處理(5 ℃、-10 ℃和-25 ℃)的轉錄組數據，發現5組三聯體對低溫均有積極的響應，其中TaCBS-10s三聯體積極響應-10 ℃低溫脅迫，表達量均在-10 ℃達到最高，在-25 ℃略有下降(圖5)；三組三聯體TaTlyc-2s、TaCBS-8s和TaCBSDCBS-1s則積極響應-25 ℃低溫脅迫(圖5)，其中TaCBS-8s在 4 ℃(圖4)、5 ℃、-10 ℃(圖5)均不表達，但在-25 ℃表達量驟然升高，TaTlyc-2s和TaCBSDCBS-1s前期表達量變化不大，在-25 ℃表達量驟然升高。三聯體TaCBS-5s在4 ℃表達量最高，在-10 ℃和-25 ℃表達量無明顯變化，可能是在前期已經響應低溫達到峰值，但在低溫條件下較高的表達量也說明了它們在植物抵御凍害的過程中發揮了重要作用。

TPM：每百萬reads中的轉錄本reads數。

Cold-1、Cold-2、Cold-3代表4 ℃處理2周。

3 討 論

CDCP可以通過與Trxs相互作用來清除ROS，所以其對于植物進行正常活動是必需的。然而目前關于在植物中對CBS基因進行系統分析的報道較少，在小麥中更是未見報道。在擬南芥中，定位于葉綠體中的CBSX1和CBSX2通過調節硫氧還蛋白從而控制H2O2水平并調節花藥內皮細胞中的木質素聚合；還可以通過調節Trxs的穩態來影響光合作用相關酶的活性，從而影響植物生長[23]。在水稻中，OsCBSX3和OsCBSX4可以調節水稻對于生物和非生物脅迫的耐受性[24-25]，在本研究中也發現了對凍害有積極響應的TaCBS基因。

滲透脅迫會導致細胞質中游離鈣濃度的瞬時增加，并且這種鈣離子濃度的急劇變化會影響下游基因的表達[26]。已有學者對擬南芥中的滲透脅迫相關基因進行了鑒定[27]，發現一些CBS基因的表達量發生改變，在鹽脅迫1 h、6 h和12 h下，CBS基因在根中上調表達；而在芽中，這些基因在鹽脅迫1 h和24 h表達量更高。對這些基因的表達模式進行分析，結果表明含有CBS結構域的蛋白質可能在干旱、鹽和滲透脅迫中起重要作用。過氧化物(H2O2)等活性氧(ROS)引起的氧化脅迫是所有需氧生物面臨的挑戰[28-29]，雖然ROS具有一定的毒性，但現在人們普遍認為，涉及ROS的氧化還原調節是調節細胞活動的關鍵因素[30]。在鹽脅迫下，氧化脅迫誘導CBS基因在根部脅迫3 h時表達，而在芽中幾乎所有差異表達的CBS基因在氧化脅迫下均上調表達[10]。最近有學者研究發現CBSDUF亞群蛋白DPS1的缺失會降低小麥的抗氧化活性，導致ROS水平上升，從而導致穗頂端變性，產量降低[31]。本研究發現雖然在5 ℃低溫下大多數CBS基因表達量并沒有明顯的變化(僅一組三聯體TaCBS-5s以及TaCBS-10B響應低溫)，但是在-10 ℃和-25 ℃下，TaTlyc-2s、TaCBS-8s、TaCBSDCBS-1s和TaCBS-10s四組三聯體表達量均有明顯的升高。尤其是TaCBS-8s，在4 ℃、5 ℃和-10 ℃都不表達，但在-25 ℃突然大量表達。說明在-25 ℃時小麥中ROS大量增加，破壞體內穩態，而CBS蛋白的大量合成可與Trxs結合，從而啟動對ROS的清除。相對來說，TaCBS-10s在溫度達到-10 ℃時表達量最高，在-25 ℃略有下降，說明它們可能有著較弱的抗寒功能，在-25 ℃時TaCBS-10s對低溫脅迫的響應程序不如TaCBS-8s等三聯體，但是它們啟動的更早，說明他們對小麥前期抵御凍害有著很大的幫助。

前人發現，在小麥中，有70%的三聯體表達模式相似[32]。本研究通過轉錄組數據也發現大多數CBS三聯體有著相似的表達模式，在CBS家族中有40對CBS基因三聯體，約占家族基因總數的88.24%。說明其由二倍體進化而來的保守性較好，但相比于功能性以及保守性強的轉錄因子如TCP(在小麥中擁有66個，分屬22組三聯體)[33]保守性略差一些。

總之，鑒于CBS基因的多樣性和重要功能，對CBS基因家族進行系統和詳細的功能研究十分必要。通過分析，我們發現了在小麥抗寒以及發育中發揮重要功能的CBS基因，為小麥CBS基因的功能解析奠定了基礎。對小麥CBS基因家族的研究對于進一步了解多倍體植物的CBS基因特點，并利用基因工程手段提高小麥抗寒性具有重要的理論和實踐意義。

致謝：感謝東北農業大學農學院付連雙老師提供小麥材料。