茶樹花香氣及茶葉氣味對中華蜜蜂的引誘效應

吳國火,崔 林,王夢馨,李紅亮,韓寶瑜

中國計量大學生命科學學院,浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室, 杭州 310018

植物揮發物在植物與昆蟲之間的信息交流過程中起著重要作用,對昆蟲的寄主植物定向行為、昆蟲產卵行為、寄生蜂的寄主尋找行為等產生影響[1]。如番茄葉揮發物對B型煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)具有行為導向作用[2],茶梢揮發物可引誘假眼小綠葉蟬Empoascavitis(G?the)[3],蟬害誘導的茶梢揮發物可引誘天敵昆蟲葉蟬三棒纓小蜂StethyniumempoascaeSubba Rao、微小裂骨纓小蜂SchizophragmaparvulaOgloblin寄生[4-5]。植物揮發物也密切影響著昆蟲的傳粉行為[6],許多植物在開花期間,由花朵釋放出多種揮發性物質,如丁香酚、苯酚等,這些揮發性化合物對傳粉昆蟲具有強烈的引誘作用,誘導傳粉昆蟲對蜜源做定向飛行[7]。

中華蜜蜂Apisceranacerana是我國特有的資源蜂種[8],其長期適應我國的氣候條件,易于發現分散、零星開花的植物花粉,在維持生態平衡方面具有重要意義；其低溫出巢的生活習性恰適宜于高寒地區以及早春和晚秋等低溫條件下開花植物的傳粉[9]。目前,對中華蜜蜂化學通訊的研究主要集中在蜜蜂自身腺體分泌的信息素[10],如工蜂那氏腺釋放的氣味具有引導和定向其他工蜂的作用[11]。生活中很早就發現植物揮發物尤其是花香,對蜜蜂具有引誘作用[12], Liu等[13]發現中華蜜蜂可識別植物花粉氣味中的酚類物質含量,對低酚性物質含量的植物花粉具有偏好性,但總體來說有關植物揮發物引誘蜜蜂的研究較少。

我國茶園面積已達300 萬hm2,約占世界茶園面積60%,因此茶樹花資源非常豐富[14]。茶樹花香氣清香略帶甜味,是秋冬季理想的蜜源。10月下旬茶樹花盛開,成群的蜜蜂涌入茶園,茶樹花展示了強大的引誘潛能。如果篩選出對蜜蜂有顯著引誘作用的茶樹花香氣組分和茶葉揮發性組分,則可更好地理解茶樹花引誘蜜蜂蜂群的機理,還能使用這些成分調控蜜蜂采集茶樹花蜜,提高訪花蜜蜂數量和訪花頻率,以便充分開發茶樹花資源,增加單位面積茶園的經濟效益。為檢測中華蜜蜂對茶樹花香氣及茶葉氣味的行為反應,本研究選用鑒定于茶樹花和茶鮮葉的揮發性組分作為味源,用Y形嗅覺儀測定其行為反應,期望篩選出能顯著調控中華蜜蜂行為的組分,以揭示茶樹花引誘中華蜜蜂的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試昆蟲：實驗用中華蜜蜂取自中國計量大學蜂場,實驗前禁食0.5 h。室內生物測定時隨機選用工蜂。

供試茶樹花味源：供試茶樹種植于中國計量大學實驗茶園(北緯30°19′29.90″,東經120°21′19.16″,海拔11 m),樹齡皆為5年；使用8個國家級茶樹良種(表1),即‘安吉白茶’、‘中茶108’、‘茂綠’、‘龍井43’、‘烏牛早’、‘鳩坑早’、‘鐵觀音’和‘金觀音’,其在我國長江中下游地區皆有大面積種植。取其茶樹鮮花作為味源,設0.25 g、0.50 g、1.00 g、2.00 g、3.00 g、4.00 g和5.00 g 共7個劑量。以潔凈空氣為CK。

供試化合物味源：從茶樹花香氣[15-18]中選擇主要的、含量較大的27種組分(表2),選擇茶葉揮發性化合物[19-20]中比較重要的24種組分(表3),這51種化合物購自Sigma公司,純度≥98%。以液體石蠟為溶劑將每種化合物配成10-6g/mL、10-4g/mL和10-2g/mL 3 個劑量,其中苯乙酮、芳樟醇、α-法尼烯、順- 3-己烯-1-醇和吲哚配成10-10g/mL、10-8g/mL、10-6g/mL、10-4g/mL和10-2g/mL 5 個劑量進行測定。每次行為測定時,分別吸取每個劑量的1 mL溶液作為味源,以1 mL液體石蠟作為CK。

1.2 Y形嗅覺儀及測定程序

Y形管由無色透明玻璃制成,兩臂與基部長度皆為15 cm,內徑為1.5 cm,兩臂夾角為120°。兩臂分別連接味源瓶(或對照瓶)、加濕瓶、空氣過濾瓶(內裝滿已活化的活性炭)和流量計,各部件之間以Teflon管連接[21]。測定時分別吸取 1 mL 味源于開口的安碚瓶,開口安碚瓶置于味源瓶中；再吸取液體石蠟 1 mL 于開口安碚瓶中,置開口安碚瓶于對照瓶中。用氣泵從Y形管基部管口抽氣,測定時調節每臂流量為120 mL /min。測定前先抽氣10 min,使Y形管味源臂中充滿待測氣味。測試時用試管將1頭中華蜜蜂從Y形管基部管口引入。蜜蜂進入之后,則逆風行進,或直線爬行,或螺旋式行進,在Y形管交叉處做一個選擇,進入Y形管的一臂,爬行5 cm記為選擇該臂,超過5 min 無反應則不計數。

51種味源的每個處理劑量分別測定20頭中華蜜蜂,每頭只用1次；每測試10頭,用無水乙醇擦洗Y形管內外壁,烘干,調換Y形管兩臂與味源瓶和對照瓶的連接位置,用于消除Y形管可能的不對稱而造成的影響。每個劑量的味源測定結束后,將 Y 形管、味源瓶等玻璃部件用重鉻酸鉀洗液清洗,于 100℃烘箱內烘干。活性炭在80℃烘4 h以解除其吸附的異味分子。

生物測定在暗室內執行,Y形管上方1.5 m處有1盞15W白熾燈提供照明。每天生物測定時間從8: 00至16: 00,這期間該蜂比較活躍。室溫25℃,相對濕度(70±3)%。

1.3 數據分析方法

使用 SPSS 22.0軟件完成數據分析。對中華蜜蜂進行室內 Y 形管嗅覺行為測定時,假設供試味源對于中華蜜蜂行為沒有影響,則中華蜜蜂趨向味源和CK的概率均為50%,則有假設測驗H0= 50∶50,對于該蜂趨向味源和CK的數量差異作χ2測驗,當P<0.05 時,則差異達顯著水平,當P<0.01 時,則差異達極顯著水平。

2 結果和分析

2.1 8個茶樹品種茶樹花氣味引誘中華蜜蜂的效應

以8個良種茶樹的鮮花作為味源,潔凈空氣為CK,當味源劑量從 0.25 g、0.5 g、1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g遞增至5.0 g時,‘安吉白茶’品種茶樹花對中華蜜蜂的吸引效果逐漸增強,當味源劑量為3.0 g時引誘的蜜蜂數與CK引誘的蜜蜂數的差異達顯著水平,味源劑量再增加時其吸引力逐漸下降。隨著味源劑量的增加,‘中茶108’品種茶樹花的吸引效果也逐漸增強,當味源劑量達到2.0 g時,其引誘效果達顯著水平,之后引誘力下降。‘茂綠’品種茶樹花對于蜜蜂的引誘效果也隨著其劑量的增加而逐漸增強,當味源劑量達到0.5 g時,其引誘的蜂數與CK之間的差異顯著,其后吸引力下降。而‘龍井43’品種茶樹花供試劑量為0.25 g時,引誘效果與CK之間的差異顯著,其后隨著茶樹花劑量的增加,吸引效果逐漸下降,當茶樹花劑量為4.0 g或5.0 g時,與CK相比則具有顯著的排斥效應。‘烏牛早’、‘鳩坑早’、‘鐵觀音’和‘金觀音’品種的茶樹花劑量為0.25 g時,對中華蜜蜂引誘效應與CK的差異顯著,隨著劑量的增加,吸引效果趨于下降,其中‘烏牛早’茶樹花劑量為5.0 g時,對供試蜜蜂還有排斥效應(圖1)。

圖1 Y 形管嗅覺儀測定的8個品種茶樹花與潔凈空氣引誘的蜜蜂數及其差異Fig.1 Difference between number of bees choosing each of eight tea cultivar flowers and number of bees choosing fresh air during Y-tube olfactometer bioassay *茶樹花與潔凈空氣引誘蜜蜂數量之間的差異性達顯著水平

8個品種茶樹花用作味源,在低劑量時吸引供試蜜蜂,隨著劑量的增加,引誘效應增強,到一定劑量時引誘效應與CK引誘效應之間的差異達顯著水平；之后,茶樹花吸引效果趨于下降。假設選擇茶樹花的中華蜜蜂數為y,供試茶樹花劑量為x,則有選擇 8個品種茶樹花的中華蜜蜂數與供試味源劑量之間的關系式(表1)。

表1 選擇8個品種茶樹花的中華蜜蜂數與供試茶樹花劑量之間的相關性

2.2 茶樹花香氣組分和茶葉揮發性組分引誘中華蜜蜂的作用

27 種茶樹花香氣組分中,苯乙酮(10-6g/mL)、芳樟醇(10-6、10-2g/mL)、莰烯(10-4g/mL)、順- 3-己烯-1-醇(10-10g/mL)、α-法尼烯(10-2g/mL)、癸醛(10-6g/mL)、β-紫羅蘭酮(10-6g/mL)、亞油酸(10-4g/mL)、順-2-戊烯-1-醇(10-4g/mL)和苯甲醛(10-2g/mL)對中華蜜蜂引誘效應與CK(液體石蠟)誘效之間差異達到顯著水平(P<0.05)。α-法尼烯(10-6、10-4g/mL)和亞油酸(10-2g/mL)對中華蜜蜂引誘效應則達到極顯著水平(P<0.01)。隨著供試劑量的增加,水楊酸甲酯、橙花醇對中華蜜蜂引誘力下降,在劑量為10-2g/mL時皆顯示顯著排斥作用(P<0.05),其中水楊酸甲酯達到極顯著水平(P<0.01)；辛醛(10-6g/mL)也表現出顯著排斥作用(P<0.05) (表2)。

表2 Y形嗅覺儀檢測的茶樹花27個主要香氣組分與液體石蠟引誘中華蜜蜂數量的差異性

24個供試茶葉氣味組分中,十八醇(10-4g/mL)、正辛醇(10-2g/mL)、吲哚(10-6g/mL)、薄荷醇(10-6g/mL)、薄荷酮(10-4、10-2g/mL)對中華蜜蜂引誘效應與CK(液體石蠟)之間差異達顯著水平(P<0.05),檸檬醛(10-2g/mL)、β-石竹烯(10-4g/mL)則達到極顯著引誘水平(P<0.01)。鄰甲苯酚(10-2g/mL)、香茅醇(10-6g/mL)、1, 3-丙二醇(10-2g/mL)、α-松油烯(10-6g/mL)、正戊醇(10-4g/mL)則表現出顯著排斥作用(P<0.05)(表3)。

表3 Y形嗅覺儀檢測的茶鮮葉24個重要揮發性組分與液體石蠟引誘中華蜜蜂數量的差異性

3 討論

本研究選用了8個大面積栽培的茶樹良種,以它們的鮮花為味源,檢測中發現低劑量鮮花引誘中華蜜蜂；隨著劑量的加大,引誘效應增強,當劑量達到一定閾值時茶樹花引誘效應與潔凈空氣引誘效應之間差異達顯著水平；之后,茶樹花劑量再增加,引誘效果則下降,個別品種茶樹花甚至顯現了排斥效應；味源質量與其引誘的蜜蜂數之間相關性顯著。本研究也還發現茶樹花香氣主要組分、茶鮮葉揮發物重要組分對于中華蜜蜂的引誘效應也顯示出類似的反應趨勢。亦即在確定空間內,隨著味源劑量的增加,供試昆蟲做出有規則的趨向反應。潘鋮等[4]用Y形管嗅覺儀檢測了葉蟬三棒纓小蜂對于健康茶梢嫩莖、葉蟬口針刺吸和產卵管刺傷茶梢嫩莖、機械刺傷茶梢嫩莖等多種味源的多個劑量的趨向反應,皆獲得了與此類似的行為反應。本課題組從擁有近3000份茶樹種質的國家茶樹資源圃(杭州)挑選了在長江中下游地區和華南地區廣泛種植的23個茶樹良種,從這23個良種香花中鑒定了79個香氣組分,發現在每個品種鮮花中苯乙酮和芳樟醇相對含量皆分別超過鮮花香氣總含量20%[15]。苯乙酮和芳樟醇的含量不僅分別超過了茶樹花香氣總量的20%,而且二者皆顯著地吸引中華蜜蜂。成片茶園開花過程中,散發的濃烈香氣和茶鮮葉氣味招引著中華蜜蜂,尤其是其中的苯乙酮和芳樟醇等組分。這是茶樹花引誘中華蜜蜂的主要原因之一。

本研究發現,苯乙酮和芳樟醇在10-6g/mL的低劑量便可顯著引誘中華蜜蜂。β-紫羅蘭酮、莰烯、Z- 3-己烯-1-醇、α-法尼烯、癸醛、亞油酸、Z-2-戊烯-1-醇和苯甲醛也顯著地引誘中華蜜蜂。然而,水楊酸甲酯、辛醛和橙花醇3個組分顯示了排斥效應。本研究檢測的24個茶鮮葉揮發物中,十八醇、正辛醇、吲哚、薄荷醇、薄荷酮、檸檬醛和β-石竹烯對中華蜜蜂有顯著或極顯著引誘效應；正戊醇、鄰甲苯酚、香茅醇、1, 3-丙二醇、α-松油烯5個組分則表現出顯著排斥作用。香葉醇、橙花醇對中華蜜蜂引誘作用沒有達到顯著水平；檸檬醛在10-2g/mL劑量時對中華蜜蜂有顯著吸引作用,這與已有的研究結果一致[22]。我們課題組發現AcerCSP3 可能作為中華蜜蜂觸角化學感受系統的一部分,在搜尋某些植物花粉蜜源時其作為氣味分子運載體而發揮一定的作用,其中β-紫羅蘭酮與AcerCSP3具有較強的競爭結合能力[23]。β-紫羅蘭酮和中華蜜蜂普通氣味結合蛋白AcerASP2的氣味識別力和結合力遠大于水楊酸甲酯、香葉醇與AcerASP2競爭結合力[24]。β-紫羅蘭酮與中華蜜蜂化學感受蛋白CSP1也有較強結合能力,為蜜蜂偏好性氣味[25]。分析認為,本研究中茶樹花和茶鮮葉揮發物中引誘中華蜜蜂的組分質和量皆顯著多于排斥中華蜜蜂的組分,茶樹花香氣和茶鮮葉氣味顯著引誘中華蜜蜂。

植物揮發物是由多種低濃度的揮發性次生代謝產物組成的混合物[26-28],昆蟲行為受多種揮發物的協同影響。因此,需要將多種單一揮發性組分按其相互間自然比例配成混合物,再測其引誘效果[29- 30]。本組將選擇顯著引誘蜜蜂的組分,按不同比例配制多種備選引誘劑,結合色板等視覺引誘技術于茶園中進行誘效檢測,期望篩選出高效的中華蜜蜂引誘劑,用于蜜蜂行為的調控。