NLRP3炎性小體與慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能相關性研究

陳忠仁 歐宗興 王蕾 沈彬 梁海梅 楊緒莉 黃實仁

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)簡稱慢阻肺，是暴露于有害顆粒或氣體后，持續的呼吸癥狀及氣流受限的一種肺部疾病。它雖然為肺部疾病，但同時也存在持續的全身性炎癥[1-2]。目前有研究以“溢出效應”解釋，認為氣道炎癥過度表達后，“外溢”至外周使血清的炎癥因子水平異常升高。但同時，外周血異常表達的炎癥因子，又可刺激氣道分泌炎癥因子，加重氣道的炎癥，這就是所謂的“炎性循環”；加重的氣道炎癥會持續破壞氣道引起氣流受限，肺功能下降，證明血清炎癥因子水平，與慢阻肺病情嚴重程度密切相關[3]。近幾年，NOD 樣 受 體 熱 蛋 白 結 構 域 相 關 蛋 白 3(NLR family, pyrin domain containing 3，NLRP3)炎癥小體作為與一種免疫相關的受體，與自身免疫疾病有著密切的聯系。本研究制備慢阻肺大鼠模型，檢測其肺功能、外周血IL18、IL1β水平及外周血淋巴細胞NLRP3炎性小體mRNA濃度，以探討三者之間的關系。

資料與方法

一、一般資料

1 動物 健康清潔級 wistar 大鼠 24 只，平均體重 220～250g，由斯萊克提供。

2 主要試劑 內毒素(Sigma)；PrimeScriptTMRT reagent Kit(for real time) RR037A，SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) RR420A( TAKARA公司)；紅梅牌香煙(紅塔集團)。

3 主要儀器與設備 RES2020型 (AniRes2005分析系統) 北京貝蘭博科技有限公司；熒光定量PCR儀(LightCycler? 96)羅氏；IL-18 ELISA 試劑盒(南京建成)、IL-1β ELISA 試劑盒(南京建成)；正置顯微鏡(BK-FL2)重慶奧特光學儀器有限公司；煙熏染毒箱(自制)。

二、實驗方法

1 動物模型的制備及分組 采用隨機數字表法將 24 只 1 月齡清潔級 wistar 大鼠隨機等分成兩組(性別相同)，分別為空白組、慢阻肺組。慢阻肺組參考宋一平的方法制備模型[4]。方法如下：第 1 和第 14 d經氣管滴入 2000 μL(質量濃度為 1 μg/μL)內毒素，后 2～30 d(第 14 d除外)，將大鼠放入 5%香煙煙霧中熏 0.5 h/d。

2 肺功能檢查 采用RES2020型 (AniRes2005分析系統)檢測。將待檢的大鼠用5%水合氯醛(0.7mL/100g)腹腔注射麻醉，切開大鼠頸部皮膚后，用鑷子鈍性分離皮下組織，暴露出氣管，氣管做一倒T型切口，插好管子，固定于體描箱內。設定好FVC參數，按平均體重設定潮氣量。檢測大鼠的用力肺活量(FVC)；0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)；肺阻力(R)；肺順應性(Cdyn)。

3 Real-time PCR檢測外周血淋巴細胞NLRP3mRNA 取大鼠外周血，分離出淋巴細胞，加入 TRIzol 提取總RNA，逆轉錄合成 cDNA。將獲得的 cDNA 按PCR試劑盒說明書方法擴增目的基因。引物Bactin-F GGAGAAGATTTGGCACCACAC，Bactin-R ACACAGCCTGGATGGCTACG，片段長度173bp。NLRP3-F AGCTCCTCTGTGAGGGACTT，NLRP3-R GAGCGTCACCACACACAGAT，片段長度179bp。反應條件: 95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s，共 40～45 個循環。計算 Ct 值，應用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

4 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測 采用雙抗體兩步夾心 ELISA 檢測大鼠血清 IL-18、IL-1β 的水平，按試劑盒說明書操作，最后通過酶標儀和計算機得出細胞因子濃度 。

結 果

一、兩組大鼠基本情況比較

空白組大鼠營養好，皮毛白皙有光澤，活動靈敏；而慢阻肺組大鼠在造模過程中逐漸出現營養不良，行動遲緩，精神萎靡，雙目無神，反應遲鈍，進食減少，皮毛枯槁發黃，觸之易脫落，可見倒豎現象，口唇發紺。

二、慢阻肺組大鼠肺組織病理

光鏡下可見慢阻肺組大鼠支氣管上皮增生增厚，肺組織大量炎癥細胞聚集，以肺泡腔為多(圖1)。

圖1 HE染色慢阻肺組肺組織病理(200×)

三、外周血炎癥因子、外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA水平與肺功能的關系

1 肺功能 比較空白組與慢阻肺組大鼠的用力肺活量(FVC)；0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)；0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值(FEV0.3/FVC)；肺阻力(R)；肺順應性(Cdyn)的差異，結果發現(表1)：空白組與慢阻肺組的FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC差異顯著(P<0.05)；空白組的肺阻力較慢阻肺組明顯降低(P<0.05)；空白組的肺順應性較 COPD 組明顯增加(P<0.05)。

2 兩組大鼠外周血淋巴細胞NLRP3mRNA水平比較 比較兩 組大鼠外周血淋巴細胞NLRP3mRNA水平，結果發現：在慢阻肺組較空白組升高(P<0.05)，差異有統計學意義(見表1)。

表1 兩組大鼠肺功能結果及外周血淋巴細胞NLRP3mRNA的表達

3 兩組大鼠血清炎癥因子水平比較 對比兩組大鼠外周血 IL-18、IL-1β 水平差異，結果發現：在 慢阻肺 組均較空白組升高(P<0.05)，差異有統計學意義(見表2)。

表2 兩組大鼠外周血炎癥因子水平差異

4 兩組大鼠肺功能指標與外周血淋巴細胞NLRP3mRNA濃度之間相關性分析 采用 Pearson 相關分析，用力肺活量、0.3秒用力呼氣容積、0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值、肺順應性與外周血淋巴細胞中NLRP3mRNA濃度呈顯著負相關(P<0.05)，而肺阻力與之為正相關(P<0.05)(見表3)。

表3 大鼠肺功能指標與NLRP3 mRNA濃度之間的相關性

討 論

慢阻肺是一種氣道慢性炎癥疾病，由有害顆粒或氣體誘發的炎性反應引起。除了大量的炎性細胞分布在患者肺部，患者血清炎癥因子水平同樣有提高[5]。同時，血清炎癥因子濃度升高，可以募集大量的炎性細胞至肺組織，產生活性氧等炎性介質，產生持續的炎癥反應，持續的炎癥反應會使上皮細胞化生、杯狀細胞增生、氣道重塑，患者會出現氣道分泌物增多，呼吸困難，肺功能的下降[6]。本研究中選擇 IL-1β、IL-18為體液免疫中刺激機體進一步釋放炎性遞質的細胞因子，可以反映慢阻肺炎癥反應的外溢現象[7]，有研究表明，慢阻肺在疾病過程中可誘導IL-18等因子的分泌[8-9]。作為近年來研究的熱點，NLRP3炎性小體在感染性疾病和炎癥性疾病中的作用日益得到重視[10]。有研究指出，NLRP3炎性小體激活后，可分泌大量的炎癥因子及活性物質，參與慢阻肺疾病的發生發展。

IL-1β主要由單核巨噬細胞分泌，參與機體各類炎性反應，并與其他細胞因子相互作用， 進一步 加重慢阻肺的氣道炎癥反應， 而氣道炎癥反應又可刺激IL-1β的合成及分泌[11]。 國外學者研究結果表明IL-1β與肺功能嚴重程度呈正相關，可使患者肺功能下降[12]。 IL- 18作為前炎癥細胞因子可誘導及增強多種細胞因子的合成、分泌及活化[13]。同樣，氣道炎癥的增強可刺激IL-18的活性及在血清的水平。[14-15 ]NLRP3 炎性小體近來研究較為透徹，當受到內外源性的刺激后，可使效應蛋白 caspase-1 活化，致細胞因子 IL-1β、IL-18 活化和分泌[16]。

本研究采用經典的煙熏加內毒素氣管滴入的方法制作慢阻肺模型，慢阻肺組的氣道病理及FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、R、Cdyn等肺功能結果均表明造模成功，同時慢阻肺組的肺功能與空白組的差異有統計學意義。慢阻肺組血清的IL-18、IL-1β水平顯著高于空白組，這與之前的研究相符合[17]，表明隨著慢阻肺的疾病進程，慢阻肺的炎性反應開始出現失衡，外周炎癥反增強。同時外周血淋巴細胞的NLRP3mRNA水平，慢阻肺組顯著高于空白組。有研究表明，慢阻肺疾病進程中，炎性小體的過度表達起了重要作用[18]。也提示我們，慢阻肺患者在受到各種刺激后，可通過激活炎性小體的合成、活化，使IL-1β，IL-18等下游因子具有生物活性，使慢阻肺的炎癥失衡更加嚴重，會造成氣道壁的破壞，管腔的縮小、肺功能的下降，本研究中，NLRP3mRNA水平與大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、Cdyn呈負相關，與R呈正相關，這也提示我們，炎性小體在慢阻肺進程中起著重要作用，既往的研究也表明了這點[19]。

綜上所述，血清中的炎性介質在慢阻肺肺功能惡化中起著重要的作用，而炎性小體可能是調節其的重要位點，這可能成為我們干預慢阻肺進程的靶點。但本研究為動物實驗，未涉及實際慢阻肺患者，且樣本量較少，缺乏干預組，使本研究具有一定的局限性。未來，可通過擴大樣本量，設置干預組，并可進行臨床實驗，來進一步明確這些指標和慢阻肺進展的關系，以指導個體化治療，延緩疾病進程。