程序性死亡受體 1和程序性死亡受體配體 1在非小細胞肺癌組織中的表達情況及臨床意義

門桐林，李雪，袁秀敏，張璐

沈陽市第十人民醫院腫瘤科，沈陽110044

肺癌是目前世界上發病率和病死率均較高的 惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（non‐small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的85%，是一種最常見的肺癌類型[1]。NSCLC早期癥狀不明顯，大多數患者就診時已為晚期，失去了手術治療的最佳時機。目前放療、化療等治療方法對晚期NSCLC患者的治療效果不佳，隨著對腫瘤免疫逃逸機制的不斷探索，研究者發現一些免疫檢查點的負性調節在NSCLC的發生發展過程中發揮著重要作用[2‐3]。 程序性死亡受體 1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD‐1）和程序性死亡受體配體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD‐L1）可以通過負性調節，降低過度免疫，保護周圍的正常組織免受損傷，從而增強腫瘤微環境對機體正常免疫的抵抗作用[4‐6]。PD‐1/PD‐L1 信號通路在微環境中能夠誘導NSCLC免疫逃逸機制的產生，導致腫瘤細胞逃避機體的殺傷作用，并在機體其他組織器官中創造腫瘤微環境，為腫瘤的擴散提供條件[7‐8]。目前PD‐1/PD‐L1信號通路成為研究的熱點問題之一，PD‐1/PD‐L1信號通路阻滯劑抗PD‐1和抗PD‐L1抗體能夠逆轉NSCLC免疫逃逸，殺死腫瘤細胞。本研究主要探討PD‐1和PD‐L1在NSCLC組織中的表達情況及臨床意義，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2015年1月至2017年1月沈陽市第十人民醫院收治的150例NSCLC患者。納入標準：①經病理檢查確診為NSCLC；②首次診斷并接受外科手術治療；③未接受過放療、化療及其他免疫治療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤及免疫系統疾病；②合并嚴重的心血管疾病或心腎功能不全；③合并感染等并發癥；④不配合治療。150例NSCLC患者中，男80例，女70；年齡26～67歲，平均（49.41±2.83）歲；病理類型：鱗狀細胞癌30例，腺癌88例，腺鱗癌32例。收集患者的NSCLC組織及其癌旁組織（距腫瘤邊緣3 cm內）各150例，所有標本取得后立刻放入液氮罐中，儲存于-80℃冰箱中保存。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測PD- 1和PD-L 1的相對表達量

分別取儲存于-80℃冰箱的NSCLC組織及癌旁組織100 mg，利用Trizol法提取RNA，應用紫外分光光度計測定RNA的質量與濃度，應用1%的核酸膠檢測RNA的完整性。應用Takara逆轉錄試劑盒將質量較好的RNA反轉錄成cDNA，儲存于-20℃冰箱中備用。采用TransStart Top Green qPCR Su‐perMix熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒檢測兩種組織中PD‐1、PD‐L1的表達情況。PD-1上游引物為5'‐AGGTGCTGAT‐GGAGAAGGA‐3'，下游引物為5'‐GTGATTG‐CAGCCACGAAC‐3'；PD-L1上游引物為 5'‐AGGT‐GCTGATGGAGAAGGA‐3'，下游引物為 5'‐GT‐GATTGCAGCCACGAAC‐3'。以甘油醛‐3‐磷酸脫氫 酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，其上游引物為 5'‐ACTTCAA‐CAGCGACACCCACT‐3'，下 游引 物 為5'‐GC‐CAAATTCGTTGTCATACCAG‐3'。PCR 反應體系（20 μl）：10μmol/L的上下游引物各 0.4μl，模板0.5μl，STBR Premix Ex Taq Mix 10μl，ddH2O 8.7 μl。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s（每次循環后采集熒光），72℃1 min，進行40個循環。采用Bio‐Rad CFX Manager軟件進行數據分析，根據溶解曲線判斷PCR產物的特異性，采用2-△△Ct法計算PD-1mRNA和PD-L1mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.3 免疫組織化學染色方法及結果判定

收集NSCLC組織及癌旁組織，應用10%的甲醛固定24 h，石蠟包埋，采用免疫組織化學染色法進行染色。應用冷凍切片機將制作的石蠟標本切割成厚度約為4 μm的切片，將切片置于含多聚賴氨酸的載玻片上進行熔蠟，然后將石蠟切片置于60℃烘箱中烘烤120 min進行固定。將切片浸泡于二甲苯中10 min，更換二甲苯再浸泡10 min；應用無水乙醇進行梯度脫水：無水乙醇浸泡10 min，重復操作1次，95%乙醇浸泡5 min，85%乙醇浸泡5 min，無菌水浸泡5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次。加入9%的檸檬酸鈉，高壓加熱10 min進行抗原修復，降至室溫后應用PBS清洗3次，每次5 min。應用3% H2O2甲醇溶液室溫孵育10 min，滅活內源性過氧化物酶，孵育后PBS沖洗3次，每次5 min。切片上滴加10%的山羊血清，37℃封閉20 min。傾倒山羊血清，按照1∶500的比例將PD‐1和PD‐L1抗體稀釋，分別加入組織切片中，4℃恒溫搖床上孵育過夜，然后應用PBS清洗3次，每次5 min。甩干切片，加入1∶1000比例稀釋的羊抗鼠、羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min。應用0.04%二氨基聯苯胺進行染色，反應部位呈黃褐色時停止染色，清水沖洗多次，再應用蘇木素復染30 s，清水沖洗3次。經85%、95%及100%乙醇進行梯度脫水，每次5 min，再應用二甲苯脫水2次，每次5 min，中性樹脂進行封片，顯微鏡下觀察。每次染色均應用山羊血清為一抗作為陰性對照。由2名病理科醫師采用雙盲法進行閱片。400倍顯微鏡下隨機選擇5個視野進行觀察。染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞所占比例評分：陽性細胞所占比例＜1%為0分，1%～30%為1分，31%～60%為2分，＞60%為3分。染色強度評分與陽性細胞所占比例評分相加，0～3分為低表達，4～9分為高表達。

1.4 流式細胞術檢測CD 4+-PD- 1、CD 8+-PD- 1、CD14+-PD-L 1、CD68+-PD-L 1的表達水平

應用PBS將收集的NSCLC組織和癌旁組織清洗干凈，將組織剪碎，溶解于Ⅳ型膠原酶中，37℃反應1 h。加入1 ml無血清RPMI‐1640培養基停止組織的溶解，充分研磨。應用PBS沖洗，離心取下層沉淀細胞，應用5 ml PBS重懸細胞，緩慢注入5 ml Ficoll淋巴細胞分離液，保證重懸的細胞沉淀與Fi‐coll的比例為1.5∶1，采用Ficoll密度梯度離心法，常溫下1800 r/min離心30 min。離心后取中間白膜層，再應用PBS沖洗沉淀3次，經分離得到外周血單核細胞，分別加入CD4‐異硫氰酸熒光素（fluo‐rescein isothiocyanate，FITC）、CD8‐FITC、CD14‐FITC、CD68‐FITC、PD‐1‐PE、PD‐L1‐PE抗體，4 ℃恒溫搖床避光孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，上機檢測前加入500 μl鞘液。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD- 1、PD-L 1 mRNA表達情況的比較

實時熒光定量PCR結果顯示，NSCLC組織中PD-1mRNA和PD-L1mRNA的相對表達量分別為（5.03±1.92）和（4.95±1.09），分別高于癌旁組織的（1.72±0.81）和（1.25±0.24），差異均有統計學意義（t=19.454、40.601，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中PD- 1、PD-L 1表達情況的比較

不同年齡、性別、病理類型、腫瘤直徑的NSCLC患者NSCLC組織中PD‐1和PD‐L1的表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移、有遠處轉移的NSCLC患者NSCLC組織中PD‐1的高表達率均明顯高于TNM分期為I～Ⅱ期、高+中分化、無淋巴結轉移、無遠處轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=9.513、10.390、11.918、9.040，P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移、有遠處轉移的NSCLC患者NSCLC組織中PD‐L1的高表達率均明顯高于TNM分期為I～Ⅱ期、高+中分化、無淋巴結轉移、無遠處轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=8.266、11.310、28.043、32.344，P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中PD‐ 1、PD‐L 1的表達情況（ n=150）

2.3CD 4+-PD- 1、CD 8+-PD- 1、CD14+-PD-L 1、CD68+-PD-L 1表達水平的比較

NSCLC 組織中 CD4+‐PD‐1、CD8+‐PD‐1、CD14+‐PD‐L1、CD68+‐PD‐L1的表達水平均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 NSCLC組織和癌旁組織中CD 4+‐PD‐ 1、CD 8+‐PD‐ 1、CD14+‐PD‐L 1、CD68+‐PD‐L 1表達水平的比較（%，± s）

表2 NSCLC組織和癌旁組織中CD 4+‐PD‐ 1、CD 8+‐PD‐ 1、CD14+‐PD‐L 1、CD68+‐PD‐L 1表達水平的比較（%，± s）

組織類型N S C L C組織（n=1 5 0）癌旁組織（n=1 5 0）t值C D 4+‐P D‐1 5 8.3 1±2 8.9 1 4 2.9 3±2 7.5 1 1 3 3.5 9 3 C D 8+‐P D‐1 5 5.9 1±2 7.9 4 4 3.7 2±2 8.9 1 1 8 8.9 8 3 C D 1 4+‐P D‐L 1 5 9.1 5±2 8.7 4 4 4.8 1±3 0.8 1 2 5.6 7 8 C D 6 8+‐P D‐L 1 5 3.7 1±2 5.5 8 4 3.8 2±2 6.9 2 9 0.3 9 3 P值0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 1

3 討論

NSCLC是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發病率與病死率均居全部惡性腫瘤的第1位，預后較差，已成為威脅人類健康的殺手。早期NSCLC的臨床癥狀不明顯，大部分患者確診時已為中晚期，失去了最佳治療時機，放療、化療是中晚期NSCLC患者的主要治療手段。然而放化療具有有效率低、不良反應較大等缺點，在機體免疫應答過程中，腫瘤可以通過逃避各種免疫監視系統完成免疫逃逸，使腫瘤細胞在機體內不斷生長增殖，隨著臨床研究的不斷深入，研究者發現腫瘤免疫逃逸可以作為治療NSCLC的重要靶點[9‐11]，其在NSCLC的發生、發展過程中發揮重要作用，該逃逸機制可為腫瘤的防治提供新方向、新思路。T淋巴細胞介導的細胞免疫應答反應在機體抗腫瘤免疫過程中扮演著重要的角色[12‐13]。T淋巴細胞的活化、增殖需要兩重信號的作用，一方面需要主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）抗原肽復合物與抗原特異性T細胞表面受體結合，另一方面需要協同刺激分子受體與其配體相互結合提供正性、負性信號作為第二信號，進而精確參與調節免疫應答[14‐15]。PD‐1是一種常見的負性協同刺激分子，主要表達于活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞以及巨噬細胞表面，通過與PD‐L1結合提供負性信號，抑制淋巴細胞的增殖，導致腫瘤細胞發生免疫逃逸[16‐17]。

PD‐1（CD279）作為CD28家族成員，屬于I型跨膜蛋白，其細胞質區含有該家族特有的酪氨酸殘基，N端序列含有VDYGEL，存在于免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine‐based inhibito‐ry motif，ITIM）中，可以募集SH‐2區域；C端含有TEYATI序列，該序列可以形成免疫受體酪氨酸轉化基序（immunoreceptor tyrosine‐based switch motif，ITSM）[18‐19]。作為PD‐1配體的PD‐L1（CD274）屬于B7家族成員，亦為I型跨膜蛋白，該蛋白由290個氨基酸組成，含有跨膜疏水區、IgC樣區、IgV樣區以及由30個氨基酸組成的胞內區，PD‐L1可以在活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞表面以及心臟、胸腺等組織中表達[20‐22]。PD‐1與PD‐L1結合后，能夠磷酸化ITSM結構域中的酪氨酸，聚集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP‐2，進而導致下游磷脂酰肌醇 3‐羥激酶（phosphatidylinositol 3‐hydroxy kinase，PI3K）與Sky發生去磷酸化，經此信號通路傳遞抑制性信號[23]。抑制信號傳遞后免疫細胞的增殖、分化受到抑制，免疫反應強度降低。PD‐1與PD‐L1結合后可以產生多種生理功能，如抑制炎性因子擴散與釋放、維持T淋巴細胞的穩定性，抑制淋巴細胞的增殖與分化，參與器官移植排斥與自身免疫疾病等，這些生理功能具有免疫負調控作用[24]。機體正常狀態下，PD‐1和PD‐L1的結合能夠維持自身的免疫耐性，防止自身免疫疾病的發生。然而機體中存在腫瘤細胞時，PD‐1與PD‐L1的結合能夠抑制淋巴細胞，導致腫瘤發生免疫逃逸。

本研究結果顯示，NSCLC組織中PD-1mRNA和PD-L1mRNA的相對表達量均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示PD‐1和PD‐L1在NSCLC組織中高表達，PD‐1和PD‐L1可能參與NSCLC的發生發展。本研究結果表明，PD‐1和PD‐L1的表達情況與NSCLC患者的TNM分期、分化程度、淋巴結轉移情況和遠處轉移情況可能有關，預測PD‐1/PD‐L1信號通路可能通過抑制T淋巴細胞的增殖與分化，使T淋巴細胞走向衰竭，導使腫瘤細胞發生免疫逃逸，促進腫瘤細胞在其他組織器官中生長。PD‐1和PD‐L1表達升高后可減少第二信號分子的來源，使T淋巴細胞的活化受到抑制，效應T淋巴細胞經誘導后失去原有功能或者凋亡，腫瘤細胞可以成功避開機體的免疫監控，在其他部位不斷增殖。腫瘤中PD‐1、PD‐L1高表達會導致機體對PD‐1和PD‐L1抗體的敏感性增加，因此其表達狀態的檢測具有重要意義[25]。本研究的流式細胞術結果顯示，NSCLC組織中CD4+‐PD‐1、CD8+‐PD‐1、CD14+‐PD‐L1、CD68+‐PD‐L1的表達水平均明顯高于癌旁組織。這可能是因為PD‐1/PD‐L1信號通路對T淋巴細胞的功能起到負性調節作用，可抑制T淋巴細胞的增殖、分化，抑制白細胞介素‐2（interleukin‐2，IL‐2）和γ干擾素（interferon‐γ，IFN‐γ）的分泌，抑制CD8+T淋巴細胞的溶解活性，誘導T淋巴細胞、B淋巴細胞以及巨噬細胞凋亡，使T淋巴細胞變成死亡或無能狀態；同時其還可以誘導Treg細胞的產生，維持該細胞特有的生物學功能，進而抑制 T 淋巴細胞的活性[26‐27]。

綜述所述，PD‐1和PD‐L1在NSCLC組織中高表達，PD‐1/PD‐L1信號通路可能在NSCLC免疫逃逸中發揮著重要作用，該通路的高表達抑制了T淋巴細胞的免疫應答，促進了腫瘤細胞的免疫逃逸，研究PD‐1/PD‐L1信號通路在NSCLC免疫逃逸中的作用可以為臨床治療NSCLC提供新的方法。