c-erb-B2在早期胃癌術后復發預測中的作用

蔡志強，蘇小巖，楊繼元

荊州市第一人民醫院腫瘤科，湖北 荊州434000

早期胃癌為局限于黏膜及黏膜下層的病變。有研究認為，早期胃癌的復發與區域淋巴結轉移無關[1]，但對于早期胃癌復發的預測，目前尚無確切的分子生物標志物。C‐erb‐B2也稱人表皮生長因子受 體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）或HER2/neu，是位于17號染色體上的原癌基因，其編碼一種185 kD的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族成員[2‐3]。c-erb-B2擴增和過表達對于促進多種腫瘤的發生、發展具有重要作用[2‐4]。本研究分析了早期胃癌復發與患者臨床特征的關系，探討了c‐erb‐B2在早期胃癌復發預測中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月至2015年12月荊州市第一人民醫院收治的178例經手術切除早期胃癌術后患者的胃癌組織標本，所有患者的隨訪資料均完整。參照日本胃癌研究學會（Japanese Research So‐ciety for Gastric Cancer，JRSGC）中關于早期胃癌的根治手術標準進行手術[5]。早期胃癌分型：隆起型、凹陷型、扁平型、混合型。淋巴結轉移（N分期）參照美國癌癥聯合委員會（American Joint Commit‐tee on Cancer，AJCC）中關于胃癌的分期標準[6]。

1.2 檢測方法

采用免疫組織化學染色（immunohistochemi‐cal，IHC）和熒光原位雜交（ fluorescence in situ hy‐bridization，FISH）技術檢測c‐erb‐B2蛋白的表達情況和c-erb-B2基因的擴增狀態。最終判定標準：IHC檢測結果為強表達（＋＋＋），則直接確定為c‐erb‐B2陽性；IHC檢測結果為陰性表達（-）和弱表達（＋），則直接判定為c‐erb‐B2陰性；IHC檢測結果為中度表達（＋＋）則判定為不確定，須進一步應用FISH行c-erb-B2基因擴增狀態檢測（但仍可能出現結果不能確定的情況）。由兩名經驗豐富的胃腸病理學專家在不知情的情況對染色結果進行審查和分析，當閱片結果不一致時，通過FISH檢測明確c-erb-B2基因的擴增情況。

1.2.1 IHC檢測所有胃癌組織標本均經福爾馬林固定，常規石蠟包埋。采用MaxEnVision法進行IHC，3 μm 厚切片，二氨基聯苯胺（diaminobenzi‐dine，DAB）顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。采用美國食品和藥品管理局（Food and Drug Adminis‐tration，FDA）認證的IHC試劑盒對c‐erb‐B2進行檢測，嚴格按照抗體使用說明書進行操作。對每張載玻片上的免疫染色進行評分[7]，細胞膜出現棕黃色顆粒為c‐erb‐B2陽性表達。隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，采用200倍光學顯微鏡觀察IHC結果。IHC檢測結果判定：細胞膜均未著色或≤10%的腫瘤細胞的細胞膜出現淡黃色顆粒，為陰性表達（-）；＞10%的腫瘤細胞的細胞膜呈淡黃色或存在隱約可見的細胞膜染色，染色間斷，未包繞細胞膜，為弱表達（＋）；＞10%的腫瘤細胞的細胞膜呈黃色或棕黃色顆粒，染色連續，包繞細胞膜，為弱至中等強度表達（＋＋）；＞10%的腫瘤細胞的細胞膜呈深棕色，染色連續，包繞細胞膜，為強表達（＋＋＋）。

1.2.2 FISH檢測c-erb-B2基因FISH試劑、探針及FISH操作步驟：石蠟包埋胃癌組織切片的預處理程序、操作步驟均按照試劑盒說明書進行，c‐erb‐B2 Hercep TestTMKit pharmDx TM Kit購自Dako Cyto‐mation公司。c-erb-B2基因的雜交信號顯示為綠色，17號染色體著絲粒區（chromosome 17 centro‐mere locus，CEP17）的雜交信號顯示為橘紅色。在熒光顯微鏡下隨機計數并觀察3個區域的陽性信號，每個區域至少計數20個以上腫瘤細胞核內的c‐erb‐B2 信號點數和 CEN17 信號點數，計算平均值。以c‐erb‐B2/CEN17信號點數的比值確定c-erb-B2的狀態，c‐erb‐B2/CEN17＜1.8提示無c-erb-B2基因擴增，c‐erb‐B2/CEN17≥2.2表示c-erb-B2基因擴增，c‐erb‐B2/CEN17處于 1.8～2.1 之間則判定為可疑[8]。若FISH檢測結果為陽性，則判定為c-erb-B2陽性；若FISH檢測結果為陰性，則判定為c-erb-B2陰性。

1.3 隨訪

對所有患者出院后進行常規隨訪。前2年每3個月隨訪一次，第3～5年每6個月隨訪一次，5年后每年隨訪一次，隨訪截至2017年12月。記錄局部復發、腹膜復發和遠處復發（包括其他器官轉移、遠處淋巴結復發和混合模式）情況。采用計算機斷層掃描（CT）、內窺鏡活檢和正電子發射斷層成像（positron emission tomography，PET）‐CT檢查觀察復發情況。

1.4 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征的早期胃癌患者復發情況的比較

178例早期胃癌患者中，14例（7.87%）患者于隨訪期間復發，包括局部復發8例、遠處復發5例、腹膜復發1例。不同性別、腫瘤浸潤深度的早期胃癌患者的復發情況比較，差異均有統計學意義（χ2=4.834、4.705，P＜0.05）；不同淋巴結轉移情況的早期胃癌患者的復發情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同年齡、分化類型、手術方式、腫瘤位置、腫瘤分型和腫瘤直徑的早期胃癌患者的復發情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

2.2 早期胃癌組織中c-erb-B2蛋白的表達情況

IHC結果顯示，178例胃癌患者中，c‐erb‐B2陽性患者13例（8例復發），c‐erb‐B2可疑陽性患者6例（4例復發），c‐erb‐B2陰性患者 159例（2例復發）。不同c‐erb‐B2表達情況（c‐erb‐B2陽性、可疑陽性和陰性）胃癌患者的復發情況比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。c‐erb‐B2陽性和可疑陽性的胃癌患者的復發率均高于c‐erb‐B2陰性胃癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），而c‐erb‐B2陽性與可疑陽性胃癌患者的復發率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖1）

2.3 c-erb-B2基因可疑陽性早期胃癌患者的FISH檢測結果

FISH檢測結果顯示，IHC結果為c‐erb‐B2可疑陽性的6例早期胃癌患者中，c-erb-B2擴增患者5例（復發4例，未復發1例），c-erb-B2未擴增患者1例（未復發）。5例c-erb-B2擴增的早期胃癌患者與1例c-erb-B2未擴增的早期胃癌患者的復發情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖2）

2.4 c-erb-B2基因狀態與早期胃癌患者復發的關系

178例早期胃癌患者中，18例患者c‐erb‐B2陽性，包括復發患者12例和未復發患者6例；160例患者c‐erb‐B2陰性，包括復發患者2例，未復發患者158例。c‐erb‐B2陽性早期胃癌患者的復發率為66.67%，明顯高于c‐erb‐B2陰性患者的1.25%，差異有統計學意義（χ2=86.733，P＜0.01）。

表1 不同臨床特征早期胃癌患者的復發情況（ n=178）

圖1 早期胃癌組織中c‐erb‐B2蛋白的表達情況（免疫組化染色，×40）

圖2 熒光原位雜交技術檢測c-erb-B2的擴增情況（DAPI染色，×1000）

3 討論

胃癌是全球惡性腫瘤相關死亡的第二大原因，東亞國家晚期胃癌的病死率最高[9‐10]。相比之下，早期胃腺癌患者的5年生存率達90%以上[11]，這歸因于早期上消化道內鏡篩查[12]。臨床特征可預測胃癌復發情況，Sawayama等[13]分析了429例未行術前化療而行胃癌根治性切除術患者的臨床特征與早期胃癌術后復發的關系，結果發現，429例患者中，有57例患者復發，且性別、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移情況、淋巴浸潤、血管浸潤與早期胃癌術后復發可能有關。

Chapelle等[14]研究發現，性別、淋巴結受侵情況是影響早期胃癌預后的重要因素。Liu等[15]發現腫瘤位置、區域性淋巴結轉移、血管侵犯是胃腺癌患者預后的獨立危險因素。本研究發觀，年齡、分化類型、手術方式、腫瘤位置、腫瘤分型和腫瘤直徑可能與早期胃癌的復發無關，但性別、淋巴結轉移情況和腫瘤浸潤深度可能與早期胃癌的復發有關。分子標記物與胃癌復發的預測有關。c-erb-B2基因能夠預測早期胃癌患者的預后，其陽性率可能與早期胃癌患者的性別、腫瘤部位、TNM分期、遠處轉移、淋巴結轉移情況、分化程度等有關[16‐17]。Kim 等[18]發現，復發組 c‐erb‐B2的陽性率約為18.8%（6/32）。本研究發現，復發患者的 c‐erb‐B2陽性率為85.7%（12/14），這可能與c‐erb‐B2的檢測方法存在差異有關。IHC在蛋白質水平檢測c‐erb‐B2的表達，由于蛋白質性質不穩定，在組織固定時會使抗原活性下降或消失，從而導致假陰性。FISH則是在DNA水平上檢測c-erb-B2基因的表達，DNA性質穩定，結構不易破壞，直觀、高度靈敏的熒光信號使不同操作者之間的判讀差異減小。

IHC具有價格低廉、方法簡便、快速、可使用普通光學顯微鏡觀察、標本可較長時間常溫保存等優點，是檢測c‐erb‐B2蛋白的首選方法，但其容易受到如標本處理、試劑、儀器及人員等因素的干擾，且其僅是一種半定量檢測方法，影響IHC結果的準確性。FISH具有特異性高、穩定性強、重復性好、定量檢測等優點，實驗過程中受到的影響較小，是檢測c-erb-B2基因狀態更加可靠的方法。2007年，美國臨床腫瘤學會/美國病理學家學院指南推薦 IHC 和 FISH 作為 c‐erb‐B2的標準檢測技術。Kim等[18]研究中c-erb-B2基因的陽性判斷標準為IHC檢測結果為2+和（或）IHC檢測結果為3+，而本研究采用IHC和FISH聯合檢測基因c-erb-B2的狀態，其陽性判斷標準為IHC3+和（或）FISH擴增。有文獻報道，IHC檢測結果為2+時，HER2基因的擴增率為12%～15%[19]。Kim等[18]的研究中，部分IHC檢測結果為2+的患者未進行FISH檢測，故造成HER2基因陽性率偏低。

綜上所述，淋巴結轉移對早期胃癌復發的預測性較高，同樣，c‐erb‐B2有助于預測早期胃癌復發。由于本研究納入的病例數量有限，c-erb-B2基因在早期胃癌復發預測中的應用仍需前瞻性研究進一步證實。