糖尿病肛瘺LncRNA芯片分析及CNC圖搭建＊

黃 俊，李心甜，馬 樂，耿越飛，沈詠梅，曾娟妮

（1. 湖南中醫藥大學，長沙 410208；2. 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007；3. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，成都 610000；4. 湖南中醫藥大學第二附屬醫院，長沙 410005）

肛瘺是在肛腸疾病中十分常見，主要是因為感染、損傷等導致肛管直腸與肛周皮膚相通的異常管道，其一般無法自愈，保守治療只能暫時緩解患者痛苦，但容易反復發作，而手術治療是根治肛瘺的主要方式之一。但是因為其發病部位比較特殊，術后創面容易污染，傷口感染概率較大，若加之合并糖尿病，則會增加創面感染概率，延長愈合時間，甚至遷延不愈，形成慢性難愈合創面。因此，積極促進肛瘺創面的愈合是我們研究的重點。LncRNA（longnon-codingRNA）是長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA，定位在細胞核或細胞質中，不被翻譯為蛋白質，早前被認定為是基因組轉錄的副產物[1,2]。隨著近年來，對于LncRNA研究越來越多，其功能也被逐漸發現。目前研究認為，LncRNA 在生命過程中扮演著重要角色，對多種生理及病理過程都有調節作用，LncRNA 表達的異常，是多種疾病（如糖尿病、癌癥等）的發生、發展的重要原因[3-6]，近幾年也有研究提出其亦參與創面愈合的調控。隨著國內外對LncRNA 認識的逐步加深，本項目旨在對糖尿病肛瘺創面差異表達LncRNA 基因芯片表達譜的基礎上，建立LncRNA 與mRNA 之間調控網絡并研究關鍵LncRNA 的作用機制，從而探討慢性難愈合創面的發病機制，為開發促愈藥物提供基礎研究。

圖1 差異LncRNA 及mRNA 的箱體圖、散點圖

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 一般資料

實驗組樣本選自3例收治于湖南省中醫院肛腸科的復雜性肛瘺合并2 型糖尿病患者，對照組樣本來源于湖南省中醫院肛腸科收治的3 例復雜性肛瘺患者，術中均用雙氧水、生理鹽水清洗傷口后，絡合碘消毒，待創面新鮮肉芽長出，用組織剪剪除創面中央直徑約0.5 cm肉芽，立即放入標本管并放于干冰中凍存，隨后立即將標本交于上海康成生物工程有限公司代為保管；標本記錄本上仔細登記患者信息；待標本收集完后由上海康成生物工程有限公司應用Arraystar 人類LncRNAV4.0版芯片完成長鏈非編碼RNA表達譜的檢測。本研究獲得湖南中醫藥大學醫學倫理委員會的批準，并將其目的及風險告知受試者，由受試者簽署同意書。

1.1.2 診斷標準

1.1.2.1 肛瘺診斷標準參照國家中醫藥管理局行業標準及中華中醫藥學會肛腸分會肛瘺診斷標準[7]，復雜性肛瘺：管道有2條以上，位于肛管直腸環以上，且有2個以上外口或內口。

1.1.2.2 2 型糖尿病診斷標準參照《中國2 型糖尿病防治指南（2017年版）》制定[8]：臨床癥狀：典型的“三多一少”癥狀，即多食、多飲、多尿和體重下降；2、實驗室檢查：空腹血糖＞7.0 mmol/L 或餐后兩小時血糖＞11.1 mmol/L。無上述癥狀的患者需再次檢查。

圖2 差異mRNAs 的KEGG 通路圖

1.1.3 納入標準

①符合上述復雜性肛瘺診斷標準；②符合上述2型糖尿病的;③簽訂知情同意書并配合觀察的患者。

1.1.4 排除標準

①低位肛瘺或1 型糖尿病患者；②合并有其他肛腸疾病者；③合并其他慢性腸道疾病，如克羅恩病、潰瘍性結腸炎患者；④孕婦及哺乳期婦女；⑤近期用抗凝藥物或搭有心臟支架患者。

1.2 微陣列芯片技術檢測lncRNA

1.2.1 總RNA提取和質量控制

標記RNA 前使用Agilent ND-1000檢測RNA 是否降解并檢測RNA濃度。

1.2.2 標記和雜交

Arraystar RNA Flash Labeling Kit 對樣品進行標記，芯片雜交實驗使用Agilent SureHyb進行。

1.2.3 數據采集和標準化

芯片經過洗滌后，應用Agilent DNA Microarray Scanner 掃描。使用Agilent Feature Extraction 軟件（v11.0.1.1)獲得采集芯片探針信號值。使用軟件Agilent GeneSpring GXv12.1進行標準化。

1.2.4 差異表達分析和功能分析

挑選差異表達LncRNA 和差異表達mRNA 的軟件為Agilent GeneSpring GXv12.1 軟件。篩選標準為2 倍差異及P ＜0.05，再進行差異表達分析，然后對差異表達的mRNAs 進行KEGG 通路分析及Pathway Map 展示，挑選出顯著mRNA 指標，將這些顯著mRNA 指標進行q-PCR 驗證，得到有意義的陽性指標，將這些陽性指標與差異LncRNA 交集得出LncRNA-mRNA 共表達網絡，并基于LncRNA-mRNA 共表達網絡挑選出不同LncRNA進行功能驗證。

2 結果

2.1 將芯片標準化后，篩選基準為2 倍差異及P ＜0.05 進行差異表達分析，發現二組有19871 個無差異lncRNA，上調差異有502 個，下調差異有1204 個；mRNAs 分析發現二組有16485 個無差異，上調差異621 個，下調差異505 個。其具體箱體圖及散點圖見圖1。

圖1 為長鏈非編碼RNA 及mRNA 的箱體圖、散點圖。箱體圖顯示檢測之后的LncRNA（A）及mRNA（B）在分布情況上趨于一致。（C）圖紅色為在糖尿病肛瘺術后創面表達上調2 倍的LncRNA，綠色為下調2 倍的長鏈非編碼RNA（P ＜0.05）。（D）紅色部分為在糖尿病肛瘺術后創面中表達上調2 倍的mRNA，綠色部分為下調2倍的mRNA。

2.2 對差異表達的mRNAs 進行KEGG 通路分析（見圖2）

圖2 為差異表達的mRNAs 的KEGG 通路分析：A為在糖尿病肛瘺術后創面中下調的10條通路分別是：細胞因子-細胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction-Homo sapiens）、阿 米 巴 病（Amoebiasis-Homo sapiens）、調節干細胞多能性的信號通路（Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells-Homo sapiens）、腎素-血管緊張素系統（Renin-angiotensin system-Homo sapiens）、JAK STAT信號傳導途徑（Jak-STAT signaling pathway-Homo sapiens）、癌 癥 的 途 徑（Pathways in cancer-Homo sapiens）、TGF-β 信號通路（TGF-beta signaling pathway-Homo sapiens）、哮喘（Asthma-Homo sapiens）、AGERAGE 信號通路在糖尿病并發癥中的作用（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications-Homo sapiens）、炎癥性腸病(IBD）（Inflammatory bowel disease（IBD）-Homo sapiens），其中下調最明顯的是細胞因子-細胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction-Homo sapiens）；B 為在糖尿病肛瘺術后創面中上調的前10 條通路，分別是：破骨細胞分化（Osteoclast differentiation-Homo sapiens（human））、利什曼病（Leishmaniasis-Homo sapiens（human））、肺結核（Tuberculosis-Homo sapiens (human)）、金葡菌感染（Staphylococcus aureus infection-Homo sapiens（human））、吞 噬 體（Phagosome-Homo sapiens（human））、抗原處理及呈遞（Antigen processing and presentation-Homo sapiens（human））、自然殺傷細胞細胞毒活性（Natural killer cell mediated cytotoxicity-Homo sapiens（human））、類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis-Homo sapiens（human））、移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease-Homo sapiens（human））、炎癥性腸病（IBD）（Inflammatory bowel disease（IBD）-Homo sapiens（human））、同種異體移植排斥反應（Allograft rejection-Homo sapiens（human）），上調最明顯的是破骨細胞分化（Osteoclastdifferentiation）通路。

圖4 內參校正圖

2.3 基于上述KEGG通路分析的Pathway Map展示

基于上述KEGG 通路分析，下調最明顯的Cytokine-cytokinereceptorinteraction，上調最明顯的是Osteoclast differentiation 通路，分別將其進行Pathway Map展示（見圖3）。

A 為糖尿病肛瘺術后創面中下調最明顯的Cytokine-cytokinereceptorinteraction-Pathway 展示圖，黃色代表有影響意義指標，有：CCL26、IL6、LIF、IL13、CSF2、IL5、HGF、IFNB1、IL2&RA、SF21、SF19、BMP2；B為糖尿病肛瘺術后創面中上調最明顯的Osteoclast differentiation-Pathway 展示圖，橙色代表有影響意義指標，有：IFNy、c-Fms、IFNGR、Ig-like R FcRy、Ig-like R DAP12、STAT1、PI3K、MKK6、NADPH、STAT1/2、AP1、CTSK、c-Fos。

2.4 對8個最有影響意義的指標行q-PCR驗證

基于上述對mRNA 的KEGG 通路分析及Pathway Map 展示，從中挑選8 個指標（BMP2、IFNB1、IL6、IL18、PIK3CB、SMAD7、SMAD9、β-actin）進行q-PCR驗證，以β-actin 作為內參標準，從而得到內參校正圖（圖4）。

從上圖4 可以了解到，BMP2、IL6、IL18、PIK3CB、SMAD7 的P 值小于0.05，說明這5 個基因有統計學意義，再結合芯片標準化后結果，這5個基因與基因標準化結果趨勢一致，表示這5 個基因為陽性，說明這5 個基因指標有意義。

2.5 LncRNA-mRNA共表達網絡圖

將Q-PCR 驗證得到的5 個有意義的mRNA 指標與相應的LncRNA 進行關系分析，從而得到LncRNAmRNA共表達網絡圖（圖5）。

圖5 LncRNA與mRNA基因共表達網絡圖

紅色標記為LncRNA；藍色標記為mRNA。正相關為實線，負相關為虛線。

2.6 基于LncRNA-mRNA的CNC圖分析

IL6 和IL18 在促進創面修復方面具有重要作用。IL6 是一種細胞因子，可由多種細胞誘導產生，并能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能，所以IL6 涉及多種炎癥相關疾病，包括糖尿病和系統性幼年類風濕性關節炎；而IL18 屬白介素-1 家族，是一種前炎癥細胞因子，可促進釋放炎性細胞因子，并調節其相互之間的作用關系，所以對于機體內炎性反應具有強大調節的作用[9]。結合LncRNA-mRNA 共表達網絡圖，選取20 個LncRNA 指標:NR_125383、T323486、 ENST00000582334、 TCONS_00018312、ENST00000418393、 TCONS_00017190、 TCONS_00019532、 ENST00000601559、 ENST00000566575、NR_109882、 NR_026913、 T301537、 NR_109774、ENST00000415536、 ENST00000610000、ENST00000412485、 ENST00000573220、 T175957、ENST00000580756、TCONS_00014747（選取 標準 為PCC 絕對值值較大且長度不超過2000），其中:NR_125383、 T323486、 ENST00000582334、 TCONS_00018312、 ENST00000418393、 TCONS_00017190、TCONS_00019532、 ENST00000601559、ENST00000566575、NR_109882 和IL6 有明顯相關性，NR_026913、 T301537、 NR_109774、ENST00000415536、 ENST00000610000、ENST00000412485、 ENST00000573220、 T175957、ENST00000580756、TCONS_00014747 和IL18 具 有 明顯相關性，說明此20 個LncRNA 或正或負影響著IL6或IL18，從而影響著創面的修復。同時我們發現該20個LncRNA 此前在不同領域中均有不同程度的報道，如ENST00000418393 通過調控HTERT 來調控胃癌細胞[10]、ENST00000580756 與血管畸形導致中風有關[11]，ENST00000566575 與肝內膽管細胞癌、胸主動脈瘤、鼻咽癌、青少年特發性脊柱側凸等有關[12-15]，NR_026913 與小細胞癌有關[16]，但在創面愈合及炎癥反應中的報道相對較少，說明這些相關LncRNA 仍有許多功能暫未得知，需要我們進一步探討，為后續的功能和機制研究提供了方向和重點，為加速慢性難愈合創面愈合的研究提供了新的思路，為開發促愈藥物提供基礎研究。

3 討論

最初，LncRNA 被認為是基因組轉錄的“噪聲”，不具備任何生物學功能，但越來越多的LncRNA 被識別并發現在基因轉錄的生物功能中發揮重要的調控作用，吸引了大量的關注，隨之也成為研究熱點，至今，已有超過12000 的LncRNAs 被收錄在人類基因組中。近年來，對于LncRNA 的研究越來越多，其中對于炎癥性疾病的研究比比皆是，比如洪宏海[17]等人發現，LncRNA-MT1JP 受到干擾后，關節滑膜細胞MH7A 的炎癥因子IL-1β、IL-6 和IL-8 表達水平明顯上調，同時該研究還發現MT1JP 可以調控p53 蛋白水平，表明MT1JP 可能通過調控p53 蛋白水平從而調控炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8在關節滑膜細胞中的表達，進一步抑制類風濕性關節炎的炎癥反應。周彩蘭[18]等人發現LncRNANONHSAG057461.1 在被PM2.5 干擾后，可以抑制炎癥因子IL-1β 的表達，同時還發現當用NFκB阻斷劑BAY11-7082 后，LncRNA-NONHSAG057461.1的 轉 錄 水 平 明 顯 降 低 ，說 明 LncRNANONHSAG057461.1 本 身 可 能 受TLR2/MyD88/NFκB通路的調控。同時lncRNA 還在人類多種疾病當中都具有調控作用，如克羅恩病，前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等[19-22]。

本研究應用微陣列芯片技術觀察lncRNA 與mRNAs 在人體樣本的糖尿病肛瘺創面及普通肛瘺創面的表達譜，篩選基準為2倍差異及P ＜0.05進行差異表達分析，發現上調差異有502 個，下調差異有1204個；mRNAs 分析發現上調差異621 個，下調差異505個。對差異表達的mRNAs 進行KEGG 通路分析及其上調、下調最明顯的通路的Pathway Map 展示，篩選出8 個最有影響力的指標，行q-PCR 驗證，得到5 個陽性基因指標，將5個陽性基因指標結合相關前期LncRNA再搭建LncRNA-mRNA 共表達網絡圖，根據已搭建的LncRNA-mRNA 共表達網絡圖，從中選取PCC 絕對值值較大且長度不超過2000 的LncRNA 共20 個，該20個LncRNA 此前在不同領域中均有不同程度的報道，為后續的功能和機制研究提供了方向和重點，為加速慢性難愈合創面愈合的研究提供了新的思路，為開發促愈藥物提供基礎研究。

綜上，本研究在國內率先應用基因芯片技術搭建LncRNA 與mRNA 的CNC 基因網絡圖，從分子生物學角度，并結合現代芯片技術，了解糖尿病肛瘺的發病機制，為全面探討LncRNA 在創面修復中的作用機制等方面提供新思路，加之近年來對LncRNA 的研究越來越深入，這將對慢性難愈合創面的治療產生深遠的影響，同時為開發促愈藥物提供方法支持和思路借鑒。