基于“活性成分-靶點-通路”網絡藥理學，探討蒙藥四味石榴散治療高脂血癥的作用機制＊

葛莎莎，李建良，蔡淑珍，圖 雅

（1. 中國中醫科學院醫學實驗中心 北京 100700；2. 中國中醫科學院中藥研究所 北京 100700；3. 內蒙古民族大學蒙醫藥學院 通遼 028000；4. 中國中醫科學院中醫藥研究發展中心 北京 100700）

蒙藥四味石榴散（阿那日-4 味散）源于《觀者之喜》，由石榴（Punica granarum L.）、肉桂（Cinnamomum cassia Presl）、白 豆 蔻（Amomum kravanh Pierre ex Gagnep.）、蓽茇（Piper longum Linn.）等四味藥組成；具有補充胃火，開胃，助消化，除巴達干赫依，揭除隱熱之掩蔽功能[1]。臨床用于不消化病、灰白巴達干、胃呆、胃火衰敗等癥。方中石榴乃是祛寒藥物之首，為主藥；肉桂味辛性熱、膩、銳、滑，具抑制巴達干赫依，祛除巴達干寒邪的作用，為輔藥；蓽茇性熱以調理體素，補充胃火，除巴達干赫依，為佐藥；豆蔻止吐，開胃，消食，補充胃火，為使藥。

高脂血癥（Hyperlipidemia）亦稱為高脂蛋白血癥（hyperlipoproteinemia），屬于代謝綜合癥之一[2]，臨床中血清總膽固醇（total cholesterol，TC）＞6.22 mmol/L或（和）甘油三酯（triglyceride，TG）＞2.26 mmol/L 即被判定為血脂異常升高[3]；我國成人血脂調查顯示血脂異常發病率為34.0%，男性發病率41.9%高于女性發病率32.5%[4]，且逐年增加；易引發動脈粥樣硬化，冠心病，腦卒中等高死亡率疾病，危害大。其發病多與飲食方式、肥胖、年齡、及家族遺傳等因素相關[5-6]。發病機制與載脂蛋白（Apo）基因突變，低密度脂蛋白受體（LDLR）異常，脂肪代謝酶活性降低等相關[7]。

蒙藥四味石榴散是經典蒙藥復方，是蒙醫治療消化不良、巴達干赫依等病的基礎方劑，比如在阿那日-4 湯復方的基礎上加紅花制成通拉嘎-5，主要用于消化不良、巴達干赫依等病。臨床研究[8-9]表明五味清濁散能夠明顯降低高脂血癥患者血清的TC、TG、LDL-C水平。方中石榴[10]、蓽茇[11]、肉桂[12]等單藥均有降血脂功效報道，但該類復方的降血脂現代研究報道較少見。網絡藥理學具有系統生物學、計算生物學、整合藥理學等多學科配合的優勢[13]，適合分析中藥及民族藥多成分多靶點多通路、整體性特點[14]，能很好提供方劑多靶點交互信息網，方便富集方劑藥理通路及闡釋作用機制[15]。因此，本研究嘗試用網絡藥理學技術將四味石榴散作用靶點與降高血脂靶點進行對接，旨在利用網絡藥理學技術探索四味石榴散降高血脂作用機制，為開發四味石榴散臨床新應用及現代醫學的基礎研究提供思路。

1 材料與方法

表1 四味石榴散活性化合物

1.1 藥物活性化合物獲取及篩選

通過TCMSP 數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[16]、化學專業數據庫（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）對四味石榴散中四味藥所含全部化合物進行搜集。根據口服利用度（OB）＞0.30 與類藥性（DL）＞0.10 制定篩選標準，將1.1 所搜集的化合物根據此標準進行篩選，以四味藥中具有藥理活性報道的化合物為優先篩選；將其輸入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫查詢并轉化為標準的Canonical SMILES格式。

1.2 活性化合物靶點預測

將1.1 活性成分的SMILES 格式文件導入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺[17]，物種屬性為“Homo sapiens”，收集預測到的所有靶點，并除重。

1.3 高脂血癥疾病潛在靶點的搜集

采用Pubmed 中疾病分類中高脂血癥相關的“hyperlipidmedia”“dyslipidemia”為關鍵詞，通過OMIM（http://www.omim.org/），DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home） ， DiGSeE （http://210.107.182.61/geneSearch/）以及GeneCard（http://www.genecards.org/）四個疾病靶點網站搜集高脂血癥的潛在靶點，并除重，與1.3 獲得的成分靶點相匹配，相一致者為四味石榴散治療高脂血癥的潛在靶點。

1.4 生物過程與通路的富集分析

將靶點導入至string（https://string-db.org/）[18]分析網站，進行靶點蛋白交互作用分析；將潛在靶點導入至Metascape[19]平臺，對四味石榴散進行GO 和KEGG通路分析，分析其結果，并采用Cytoscape3.5.1[20]和GraphPad Prism 7.0軟件對結果可視化。

2 結果

2.1 四味石榴散活性化合物

四味石榴散中石榴主要含有鞣質、生物堿、黃酮類等成分，蓽茇主要含有生物堿、萜類、揮發油等成分；肉桂、白豆蔻主要以揮發油成分為主。利用TCMSP 數據庫和化學專業數據庫，通過口服生物利用度和類藥性制定標準篩選，最終獲得16個具有較高活性的化合物（見表1）。

2.2 靶點預測及篩選

基于Swiss Target Prediction 平臺來預測活性化合物的潛在靶點，篩選probability ＞0并除重，共獲得391個靶點。通過與DisGeNET、GeneCard、OMIM、DiGSeE疾病數據庫中高脂血癥的相關靶點進行比對，最終篩選出35 個可能與四味石榴散治療高脂血癥相關的靶點（表2）。

2.3 基因功能和通路富集分析

2.3.1 靶點互相作用分析

利用String 分析得出12 個聚類結果，最高enrichment score 為3.06，包 含 脂 質 代 謝（lipid metabolism）、類固醇代謝（steroid metabolism）、膽固醇代 謝（cholesterol metabolism）、固 醇 代 謝（sterol metabolism）四個條目（見圖1）。聚類結果顯示，HMGCR、PPARA、PPARG、HIFA1、IL-6 等靶點與其他靶點蛋白連接較多。

表2 35個可能與四味石榴散治療高脂血癥相關的靶點

圖1 靶點相互作用結果圖

2.3.2 GO通路分析

將四味石榴散治療高脂血癥的35 靶點上傳到Metascape 平臺，經GO 注釋分析分子功能(Molecular Function，MF）和生物過程(biological process，BP），設置閾值P＜0.01，minimum count 3、enrichment factor ＞1.5，共收集到374 條MF 條目，360 條BP 條。通過Kappa scores 作為相似性參數，將相似性＞0.3 的條目進行分層聚類分析并通過Cytoscape3.5.1 軟件繪制富集分析聚類網絡圖（圖1A、圖1B），每個條目由節點表示，圓形大小與輸入基因的數量成正比，而相同顏色的節點屬于同一簇，每一簇當中選擇P 值作為代表展示在右下角。具有相似性得分＞0.3 的條目由邊連接，邊的粗細表示相似性得分的高低。

圖2 GO注釋分析圖

圖3 KEGG富集分析熱圖

四味石榴散35個預測靶點的BP 富集結果顯示大部分與脂質定位，合成，轉運（lipid localization, lipid biosynthetic process，lipid transport）、膽 固 醇 代 謝（steroid metabolic process）、羧酸代謝（monocarboxylic acid metabolic process）等生物過程相關，另與激素水平的調節（regulation of hormone levels,hormone metabolic process）聯系密切；MF 富集結果顯示與多肽反應（response to peptide），脂質儲存功能（lipid storage），受體合成（receptor biosynthetic process）等分子功能有關。

2.3.2 KEGG通路富集分析

基于Metascape 網站的KEGG 富集分析平臺，將35個活性靶點導入，富集分析共獲得31條KEGG 信號通路，通過聚類分析，選擇有代表性的條目采用GraphPad Prism 7.0 對其結果進行熱圖可視化（圖3）。有脂肪消化與吸收（Fat digestion and absorption）、Thelper type 17 （Th17） 細 胞 分 化（Th17 cell differentiation），花生四烯酸代謝（Arachidonic acid metabolism），PPAR 通路（PPAR signaling pathway），膽汁分泌（Bile secretion），血管平滑肌收縮（Vascular smooth muscle contraction），腺苷單磷酸信號通路（cAMP signaling pathway），神經活動受體-配體相互作用通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）。

2.3.3 四味石榴散治療高脂血癥“活性成分-靶點-通路”

將上述所得到的的化合物、作用靶點和富集的GO 與KEGG 通路信息導入Cytoscape 軟件中構建“活性成分-靶點-通路”網絡。在輸出的網絡（圖4）中，以不同顏色的節點表示化合物、靶點以及作用通路，其中：黃色菱形節點代表全石榴活性成分，紅色六邊形節點代表作用靶點，淺藍色長方形代表作用通路。若某一靶點為活性化合物的潛在靶點，則以邊相連，若某一蛋白對某條通路具有調節作用，也通過邊連接。從圖中可以看出四味石榴散具有多種活性成分，每種成分對應多個作用靶點及通路，體現出“一對多”和“多對一”藥理作用關系。

3 討論

圖4 四味石榴散化合物-靶點-通路網絡圖

蒙醫理論認為，高脂血癥是由于飲食不節，過食甘涼、油膩食物，引起體內消化巴達干增盛，三根紊亂，胃火衰敗，繼而肝臟的色變希拉無法“分清泌濁”導致血中精華不消，糟粕粘液增多引發高脂血癥[21]。現代醫學認為，高脂血癥屬于代謝不良疾病，甘油三酯和膽固醇產生過多或代謝減慢導致血漿中LDL 升高[3]，甚至堆積在血管壁引發心血管疾病[22]；蒙醫常選用以調理胃火，祛巴達干寒，消食，開胃的石榴為主藥的復方制劑，譬如四味石榴散、五味清濁散（四味石榴散加紅花）等。為發掘復方蒙藥降高血脂的研發開辟新途徑，在防治高血脂癥領域里增添蒙醫藥的新內容，本研究利用網絡藥理學技術探索了四味石榴散主要活性成分，對接了與高血脂相關的靶點及作用通路，闡述了蒙醫治療高脂血癥的物質基礎及與現代醫學的聯系。

String 靶點蛋白相互作用網絡圖顯示HMGCR 與其他靶點聯系密切，HMGCR 為膽固醇合成過程的限速酶，提示蒙藥四味石榴散可能是通過下調HMGCR活性，限制膽固醇合成，下調LDL 降低高血脂。GO 富集分析結果顯示集中在脂肪酸的合成、轉運和代謝，以及胰島素和激素水平調節有關，說明四味石榴散通過多靶點起效，從糖脂代謝到激素調節都有參與降脂的生物過程；KEGG 富集分析顯示主要參與通路有脂肪酸代謝通路，PPAR 信號通路，文獻報道PPAR 可調控肝臟內的脂肪酸氧化代謝，降低甘油三酯，維持脂質穩態[23]，提示四味石榴散作用靶器官可能為肝臟，通過提高肝內脂肪酸的氧化分解降低LDL的生成。

成分-靶點-通路網絡充分展示了四味石榴散多成分、多靶點、多通路治療高脂血癥的作用特點。方劑中含有的槲皮素可降低血清和肝組織TC，TG 含量，激活PPARγ/LXRα通路[24]提高清道夫受體表達從而降低膽固醇蓄積[25]；鞣花酸具有抑制內源性TC、TG 合成，升高HDL-C，促進膽固醇逆轉運，改善脂質在體內的沉積，具有抗氧化保護肝細胞功能[26]；胡椒堿及其衍生物可調節脂代謝紊亂[27]，能有效降低高血脂地鼠血清TC、TG 水平[28]；蓽茇寧可上調高血脂地鼠LDLR 數量，降低ApoB數量，增加LDL代謝來降低血脂水平[29]。蒙藥四味石榴散方劑中的槲皮素，鞣花酸，胡椒堿，蓽茇寧預測出靶點較多，富集的通路LogP 值高，提示在方劑中這些化合物活性高，起主要降血脂作用，與文獻報道相一致。另免疫系統在本研究結果中表現突出，參與血脂調節密切，花生四烯酸途徑說明機體高血脂狀態容易引發炎癥；Th17 細胞為CD4+T 細胞分化亞型之一，與調節性T 細胞（Treg）為一對平衡，文獻報道高脂血癥會使肝T 細胞向Th17 分化，Treg 細胞功能降低，機體處于免疫亢進狀態，易引發由高血脂轉變的動脈粥樣硬化等心血管疾病[30-31]，因此Th17 細胞分化通路參與提示適應性免疫在高脂血癥發病中發揮重要作用。

生物信息學的快速發展使得小分子化合物庫得以全面建立，目前，已構建出TCMSP 等多種適合研究篩選中醫藥活性小分子的化合物庫，結合分子對接技術可展現出中藥藥效的物質基礎，初步闡明既包括中醫藥多靶點多通路整體論治的特色，也具有現代化醫藥精準醫療的理念；符合中醫藥現代化和推廣國際的方針；同時，民族醫藥也緊隨其后，本研究中的蒙藥四味石榴散在臨床應用已久，主要機理為“分清泌濁”，但具體作用機制尚未明確，通過對蒙藥四味石榴散進行網絡藥理學研究發現，其可通過cAMP 信號通路、PPAR 信號通路、PI3K-AKT 信號通路等起到調節血脂，降膽固醇作用，為臨床應用提供了理論基礎。目前，基于計算機模擬的網絡藥理學具有一定局限性，算法的匹配程度直接影響對接結果，其準確度還需實驗驗證，但仍不失為一種有力手段。

綜上所述，蒙藥四味石榴散可通過干預與脂肪酸代謝、激素調節、免疫穩態等相關通路，起到祛巴達干赫依的作用來治療高脂血癥，為進一步臨床應用和基礎研究提供了思路。