蜂膠降脂方對高脂血癥模型斑馬魚的降血脂作用研究＊

李心怡，陳荷清，夏 歡，林 生，商洪才，田貴華＊＊

（1. 北京中醫藥大學東直門醫院 北京 100700；2. 北京奧金達農業科技發展有限公司 北京 101507）

高脂血癥（Hyperlipidemia）是常見的脂質代謝性疾病，主要表現為甘油三酯（Triglyceride，TG）、膽固醇（Cholesterol，TC）、低 密 度 脂 蛋 白（Low density lipoprotein，LDL-C）及高密度脂 蛋 白（High density lipoprotein，HDL-C）的代謝異常[1-3]。2012 年流行病學調查顯示，中國成人血脂異常的患病率約為40.40%[4]；另有調查表明，全國高膽固醇血癥的患病率為4.9%，高甘油三酯血癥的患病率為13.1%[5]。高脂血癥是心腦血管疾病的重要危險因素之一，其防治已成為預防和控制心腦血管事件發生的重要措施。

臨床上推薦在控制飲食及保持運動的基礎上，使用他汀類藥物控制血脂。他汀類藥物雖能取得較好的降脂作用，但仍存在使轉氨酶升高、血糖升高、胃腸道癥狀等不良反應[6-7]。因此，如何在降脂同時減輕不良反應是高脂血癥研究關注的重點之一。中醫理論中的“膏脂”與臨床中血脂的涵義相近，其形成多與脾虛、痰濕相關，正如《王氏醫存》所言：“肥人多痰，肥人之病，皆因脾濕所致”。故中醫藥在治療高脂血癥時多從健脾化痰入手，具有療效好、副作用小等優點[8]。蜂膠降脂方主要由藥食同源的蜂膠、紅曲、山楂組成，其中蜂膠、紅曲、山楂均有降脂化濁的功效，且更為安全、不良反應小。本研究擬對蜂膠降脂方的降脂功效進行研究，并探索該組方對TG和TC的具體調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

黑色素等位基因突變型半透明Albino 品系斑馬魚由杭州環特生物科技股份有限公司提供。斑馬魚以自然成對交配繁殖方式進行養殖，飼養于28℃的養魚用水中（水質：每1L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，電導作用為480-510 μS/cm；pH 為6.9-7.2；硬度為53.7-71.6 mg/L CaCO3），實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。飼養管理符合國際AAALAC認證的要求。

1.1.2 實驗藥物的制備

本研究選用的蜂膠降脂方來源于本課題組研究團隊臨床實踐的經驗總結，主要由蜂膠、紅曲、炒山楂、荷葉和炒杜仲共5種藥物組成，實驗所用各生藥均為10 g，其中研究所用蜂膠由北京奧金達農業科技發展有限公司提供，其余生藥由東直門醫院中藥房提供。實驗前，研究人員將蜂膠原品打粉備用。用純水浸泡除蜂膠外的其余生藥，30 min后倒出純水，加入蜂膠粉末，再加純水500 mL 至煮沸并持續煎煮20 min，然后將所得藥液倒入量杯中。再次添加純水500 mL沸水煎煮15 min，倒出第二煎藥液，合并兩煎藥液并濃縮至300 mL作為母液，母液為棕色液體，置于4℃冰箱備用。

阿托伐他汀鈣（白色粉末，批號為LRAA9254，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用二甲亞砜（DMSO）配制成濃度為24 mg/mL 的母液，稀釋1000倍，置于4℃冰箱備用。實驗時阿托伐他汀鈣溶液濃度為0.24 μg/mL。

1.1.3 儀器與試劑

實驗所需儀器與相關試劑包括：解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，日 本）；心 跳 血 流 分 析 系 統（ViewPoint Life Sciences，法國）；與顯微鏡相連的相機（VertA1）；精密電子天平（CP214，OHAUS，美國）；多功能酶標儀（Mithras LB940，Berthold Technologies）；6 孔板（Nest Biotech，中國）；96 孔酶標板（costar，美國）；甲基纖維素（Sigma，美國）；鳥類用蛋黃粉（批號20170626，北京開元牌）；油紅O（Oil Red O，批號SLBP5248V，Sigma）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma，法國）；甘油三酯（TG）測試盒（批號20190327，南京建成）；總膽固醇（Total Cholesterol，T-CHO）測試盒（批號20190325，南京建成）。

1.2 分組與方法

1.2.1 實驗分組

挑選受精后發育正常的斑馬魚，首先進行藥物最大耐受濃度測定（Maximum talerated concentration，MTC）。將中藥母液按比例進行稀釋并分為5組，各組濃度分別為1.5625 μL/mL、3.125 μL/mL、6.25 μL/mL、12.5 μL/mL 及25 μL/mL。將180 尾斑馬魚隨機分為6組，每組30 尾，其中5 組分別給予不同濃度的中藥湯藥溶液，另有1 組為正常對照組，給予養魚用水飼養。根據MTC 結果進行蜂膠降脂方降血脂實驗，實驗中將斑馬魚隨機分為正常對照組、高脂血癥模型組、中藥實驗組及阿托伐他汀鈣對照組。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 MTC測定

隨機選取180 尾受精后7 天（7 days post-fertiliza?tion，7dpf）的斑馬魚置于六孔板中，每孔（實驗組）處理斑馬魚30 尾，分別給予1.5625 μL/mL、3.125 μL/mL、6.25 μL/mL、12.5 μL/mL、25 μL/mL 的中藥湯藥和養魚用水，每孔（實驗組）容量為3 mL。48 h 后觀察并記錄斑馬魚的表型和死亡情況。

1.2.2.2 蜂膠降脂方的降血脂作用研究

隨機選取5dpf 的斑馬魚置于燒杯中，用蛋黃粉溶解成0.1%水溶液喂飼斑馬魚，每天喂食8 小時，建立高血脂模型。模型建立后，隨機選取90尾模型斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）容量3 mL，處理斑馬魚30尾；分別予中藥湯藥、阿托伐他汀鈣溶液及養魚用水，其中中藥湯藥濃度根據MTC 結果確定，阿托伐他汀鈣溶液濃度為0.24 μg/mL。同時，設置正常對照組斑馬魚30尾，給予養魚用水。48 h后將斑馬魚取出用0.3%的油紅O 液進行染色。3 h 后進行脫色再置于解剖顯微鏡下觀察斑馬魚尾部血管油紅O 附著情況，計算血脂光密度總和（Total light density of blood lipid，S）。

1.2.2.3 蜂膠降脂方的血脂代謝機制研究

隨機選取5dpf 的斑馬魚置于燒杯中，用蛋黃粉喂飼斑馬魚建立高血脂模型。模型建立后，隨機選取120尾模型斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）容量3 mL，處理斑馬魚30尾。中藥湯藥組3組，分別予0.69 μL/mL（1/9 MTC）、2.08 μL/mL（1/3 MTC）和6.25 μL/mL（MTC）濃度的中藥湯藥稀釋溶液，阿托伐他汀鈣組予0.24 μg/mL濃度的稀釋溶液。另設置正常對照組和模型組各30尾，予養魚用水。48 h 后隨機取出部分斑馬魚加入勻漿介質，進行勻漿并離心，后取上清液再用TG 及TC 試劑盒測定TG 及TG 含量。另隨機選取斑馬魚置于心跳血流分析系統下觀察其血流速度的變化。

2 觀察指標

2.1 血脂光密度總和（S）

研究員用油紅O 對斑馬魚進行染色。取出斑馬魚固定后，用PBS 洗脫。室溫下，用丙二醇進行脫水。脫水后，將斑馬魚放于0.5%的油紅O 染色液中，染色過夜。過夜后，用丙二醇進行脫色。脫色完成后，洗脫，置于甘油中保存。觀察時，將斑馬魚置于解剖顯微鏡下拍照，觀察斑馬魚尾部血管油紅O 附著情況，利用Image-Pro Plus 6.0 高級圖像處理軟件進行圖像分析并采集數據，分析統計斑馬魚尾部血管血脂光密度總和（S），根據光密度總和的統計學結果評價中藥湯劑的降血脂作用。降血脂作用計算公式如下：

2.2 甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）

研究員在各組處理48 h 后，隨機取出部分斑馬魚加入勻漿介質，進行勻漿并離心，以1500 g 離心5 min后取上清液。離心管于室溫靜置15 min 后再用TG 及TC 試劑盒測定斑馬魚體內TG 和TC 的含量，根據TG和TC 的含量結果評價蜂膠降脂方對高血脂模型斑馬魚TG和TC的影響。

2.3 血流速度

各組處理48 h后，每組隨機挑選10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統下錄制斑馬魚血流視頻，分析斑馬魚血流速度，以血流速度的統計學分析結果評價蜂膠降脂方對斑馬魚血流速度的改善作用。心跳血流分析系統采用120 幀/秒高速攝像頭和IEEE 800 Mbits 高速攝像頭適配器，可輕松自定義靜脈/毛細管位置的用戶界面，實現視野范圍內的多個粒子的跟蹤，可進行實時視頻捕獲，進行高速視頻分析。

3 統計方法

統計學處理連續型變量結果用mean ± SE 表示，數據處理用SPSS20.0 進行統計分析。其中，血脂降低作用（%）用T 檢驗進行統計分析，P＜0.05表明具有顯著性差異。蜂膠降脂方對TG和TC的影響及對血流速度的作用，運用方差分析和Dunnett’s T-檢驗進行統計學分析，P＜0.05表明具有顯著性差異。

表1 蜂膠降脂方處理后“濃度-致死性”結果（n=30）

4 結果

4.1 最大耐受度（MTC）結果

蜂膠降脂方在濃度為1.5625-6.25 μL/mL時，毒性表型上未見明顯異常，死亡率為0%；在濃度為12.5 μL/mL 時，6.7%斑馬魚死亡（2/30）；而濃度為25 μL/mL 時，全部斑馬魚死亡（30/30）。故蜂膠降脂方對斑馬魚的最大耐受度（MTC）為6.25 μL/mL。具體結果見表1。

4.2 油紅O染色及血脂光密度總和（S）結果

油紅O 染色結果顯示，正常組斑馬魚尾部血管無明顯油紅O 附著，高脂血癥模型組斑馬魚尾部血管可見大量油紅O 染料沉積，而阿托伐他汀鈣組和蜂膠降脂方組斑馬魚尾部血管的油紅O 染料附著較模型組明顯減少。具體結果見圖1、圖2。計算各組的血脂光密度總和，模型組斑馬魚尾部血管光密度總和為10683 像素。阿托伐他汀鈣組及蜂膠降脂方組與模型組相比，血脂降低作用分別為31% 和33%（P＜0.001）。這表明蜂膠降脂方與阿托伐他汀鈣均有明顯的降血脂作用。具體結果見表2。

4.3 TG及TC含量變化

如表3所示，模型組TG 含量較正常對照組明顯增多（P＜0.01）。阿托伐他汀鈣組TG 的整體含量（0.059 mmol/gprot）與模型組（0.135 mmol/gprot）相比明顯 較低（P＜0.01）。而蜂膠 降脂 方0.69 μL/mL、2.08 μL/mL 及6.25 μL/mL 濃度組斑馬魚整體TG 含量分 別 為 0.064 mmol/gprot、0.052 mmol/gprot 和0.066 mmol/gprot，均低于模型組（P＜0.01）。故蜂膠降脂方和阿托伐他汀鈣均能降低斑馬魚TG 水平。正常對照組（0.080 mmol/gprot）與阿托伐他汀鈣組（0.157 mmol/gprot）TC 含量均低于模型組（0.258 mmol/gprot），P＜0.05，差異有統計學意義。蜂膠降脂方各濃度組斑馬魚整體TC 含量與模型組比較，P值均大于0.05，提示蜂膠降脂方各濃度組的TC 含量變化與模型組無統計學差異。故在本實驗濃度條件下，蜂膠降脂方降低斑馬魚整體膽固醇水平作用不明顯。

圖1 造模后斑馬魚尾部油紅O染色情況

圖2 各組處理后斑馬魚尾部血管血脂染色情況圖

4.4 血流速度變化

如表4 所示，模型組斑馬魚整體血流速度較正常組明顯減緩（P＜0.001）；阿托伐他汀鈣組的血流速度（374 μm/s）與模型組（289 μm/s）比較，其血流速度增加64%（P＜0.01），故阿托伐他汀鈣能有效改善高脂血癥斑馬魚整體血流速度。而蜂膠降脂方各濃度組處理后的血流速度及血流改善作用與模型組對比，其P值均大于0.05，提示蜂膠降脂方組斑馬魚的血流速度與模型組相比無統計學差異。

5 討論

高脂血癥是常見的脂代謝異常疾病，其引起的血液流變學異常和血流動力學異常是導致心腦血管事件發生的重要環節。高脂血癥患者TG、TC 和LDL-C水平的升高，以及HDL-C水平的降低易使紅細胞膜黏度增加，膜流動性降低，其變形能力減弱，攜氧和運輸氧氣的能力減弱造成組織缺氧、微循環障礙。同時，TC水平的升高推動了脂質在動脈內壁沉積，加速動脈粥樣硬化形成[9]。大量研究表明，高甘油三酯血癥易增加冠心病、腦卒中和眼底病變等血管相關性疾病風險[10-12]，對糖尿病腎病的疾病進程也有推動作用[13-14]。2016 年《中國成人血脂異常防治指南》指出，TG 的輕中度增高與動脈粥樣硬化性心血管疾病的發病風險相關[5]；且一項研究表明，男/女患者血液中TG 每升高1 mmol/L，其心血管疾病的發生率分別增加32%和76%[15]。一項meta分析結果顯示，TG每升高1 mmol/L，動脈粥樣硬化性心血管疾病的患病風險增加22%[15]。此外，TG嚴重增高還可提高急性胰腺炎的發病風險[5]。而高膽固醇血癥也是引起心血管疾病增加的主要原因之一，可明顯提高冠心病、腦卒中的發病率[16]；降低TC水平可顯著減少冠心病的發病率及死亡風險[17]。

故治療高脂血癥是預防冠心病和腦卒中等致死、致殘性疾病的重要措施。臨床干預時，首推他汀類藥物，其能有效降低TG、TC 及LDL-C 水平，中等劑量他汀類藥物在降脂基礎上能顯著降低冠心病事件發生率，且不增加非心血管病風險[6]。但他汀類藥物在取得良好療效的同時，仍有少量不良反應，如肝功能異常、肌痛、血糖異常等，將影響患者的整體療效及遠期獲益。

中醫藥在治療高脂血癥時，多認為高血脂水平屬于“痰濕”范疇，與患者平素多食肥甘厚膩、飲食不節導致痰濁內生，或素體脾虛、年老體虛導致脾虛不能運化，濕濁停聚，化為脂濁相關[18-19]。此外，脂質水平升高，即膏脂運化失司，可使氣血運行不暢，滯而為瘀；加之久病或年老氣虛推動無力，血行不暢而瘀血內生，故高脂血癥在中醫主要與“痰濕”“瘀血”等病理產物相關。治療時以健脾和胃、化濕降濁及活血化瘀為主。

表2 各組處理后高脂血癥模型斑馬魚的降血脂分析結果（n = 10）

表3 各組處理后斑馬魚TG和TC分析結果（n = 3）

表4 處理后斑馬血流速度結果（n = 10）

本課題組通過對比阿托伐他汀鈣，研究了蜂膠降脂方對高脂血癥模型斑馬魚的降血脂作用。結果表明，蜂膠降脂方能減少其尾部血管的血脂附著，降低體內TG 水平；但對TC 水平的調控及血流速度的改變無統計學差異。故蜂膠降脂方能通過降低TG 水平改善高脂血癥模型斑馬魚的血脂異常情況。

蜂膠降脂方以蜂膠、紅曲、山楂等藥食同源的藥物為主，配伍荷葉、炒杜仲共同起到降脂化濁的功效。其中，蜂膠收錄于2005 版《中華人民共和國藥典》，具有補虛弱、化濁脂、止消渴的功能[20]。蜂膠含有的黃酮類物質能有效降血脂、擴張冠狀動脈、清除自由基等[21-22]，并且黃酮類物質的含量越高，蜂膠的輔助降脂作用越顯著[23]。而紅曲味甘，性溫，是秈米發酵的產物，具有健脾消食、活血化瘀之效。有研究發現，紅曲中含有的洛伐他汀是膽固醇合成酶HMG-CoA 還原酶的抑制劑。紅曲中的洛伐他汀可抑制HMG-C0A 還原酶進而減少TC 合成[24-26]。動物實驗結果也發現，紅曲能降低高脂血癥模型大鼠TC、TG 和LDL-C 的水平[28]；而臨床研究結果提示，紅曲能改善老年冠心病患者的血脂水平[28]。山楂可消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂，適用于嗜食肥甘厚膩導致的痰濕蘊脾。同時，現代研究表明山楂也含有黃酮類物質。另外，山楂內含有的三萜類物質可通過提高CYP7A1、LXRα、FXR 等脂代謝相關基因的表達水平量，促進膽汁酸合成及膽固醇排出體外[29-32]。荷葉入肝、脾、胃經，有清暑化濕之效。藥理學研究顯示，荷葉提取物能降低小鼠血清中TC、TG 及LDL-C 的水平，且荷葉提取物能調控小鼠HMGCR、SREBP-2、LXRα 及CYP7a1 的基因表達，影響其肝臟組織中TC 的合成與分解代謝[33]。此外，研究表明，杜仲中含有黃酮、綠原酸及環烯醚萜類化合物也具有較好的降血脂作用[33-34]。

綜上所述，蜂膠降脂方中諸藥能協同起到化濁降脂之效，降低高脂血癥中TG 水平以改善高脂血癥。但本研究仍存在一定不足，需進一步研究、探索。一方面，本研究結果顯示對TC 水平的調控作用無顯著差異，而相關研究已證實紅曲、荷葉等單味藥對TC 水平具有調節作用，故本研究擬進一步進行動物實驗，探索組方中各味藥物是否存在相互作用；另一方面，由于實驗限制，在斑馬魚實驗中未能探討蜂膠降脂方對LDL-C 及HDL-C 的調節作用，而LDL-C 及HDL-C是血脂代謝的重要指標，故本課題組將在后續動物實驗中對其進行探索、研究。

本研究所用蜂膠均由北京奧金達農業科技發展有限公司提供，感謝其對本研究的支持與幫助。