慢阻肺氣虛證大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)＊

李 帥，林大禹，楊博鴻，侯春英，郭淑貞，王青青

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一組以不完全可逆氣流受限為特征的肺部疾病，簡(jiǎn)稱慢阻肺。疾病呈進(jìn)行性發(fā)展，后期可引起全身各組織器官的損害。據(jù)報(bào)道，全球40歲以上成年人的COPD患病率在5%～19%[1]，預(yù)計(jì)到2030年可能每年有超過(guò)450 萬(wàn)人死于COPD 及其相關(guān)疾病。在中國(guó)，COPD 已經(jīng)成為威脅人們生存健康、造成經(jīng)濟(jì)損失的主要疾病之一[2]。中醫(yī)認(rèn)為慢阻肺多屬“咳嗽”、“哮證”“喘證”、“肺脹”范疇[3]，在COPD 患者中，氣虛證出現(xiàn)的頻次是非常高的。COPD 氣虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)相關(guān)研究，將進(jìn)一步豐富和發(fā)展中醫(yī)藥理論，為氣虛證的診斷提供候選的客觀指標(biāo)、為藥物研發(fā)提供新的靶標(biāo)，對(duì)于氣虛證臨床診斷水平的提高及藥物研發(fā)也具有重要意義。

線粒體分裂和融合蛋白作為線粒體內(nèi)環(huán)境調(diào)控的重要蛋白，其融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡能力的下降、融合與分裂的不平衡可能是導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝紊亂的原因之一[4]。在臨床上，COPD 氣虛證患者常表現(xiàn)出骨骼肌肌力下降，線粒體作為骨骼肌運(yùn)動(dòng)所需能量腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的生成場(chǎng)所，其分裂和融合之間的平衡對(duì)于維持骨骼肌能量供應(yīng)顯得極為重要。基于對(duì)氣虛內(nèi)涵的理解和對(duì)現(xiàn)代研究的總結(jié)，我們提出COPD 的病變器官和骨骼肌的能量代謝障礙可能是疾病特異性和氣虛證共性的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此本研究以建立COPD 病證結(jié)合大鼠模型為目的，以不同時(shí)間段收集的大鼠宏觀表征、體重、抓力和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為切入點(diǎn)；并通過(guò)檢測(cè)Drp1、Mfn1 蛋白表達(dá)和ATP 含量變化，探索其作為COPD 氣虛證大鼠模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的可行性，對(duì)氣虛證生物學(xué)基礎(chǔ)的探索和闡釋起到重要的推動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)（SPF）雄性SD 大鼠60 只，體重180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)溫度20℃-24℃，正常飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。所有操作流程及飼養(yǎng)條件均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理飼養(yǎng)條例，并遵循人道主義原則。

1.2 試劑、耗材和設(shè)備

脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：O111：B4），萬(wàn)寶路香煙（龍巖煙草工業(yè)公司，煙氣煙堿量0.8mg/支、焦油10 mg/支，煙氣一氧化碳量11 mg/支），水合氯醛（源葉生物），內(nèi)參GAPDH，Proteintech 公司，1∶2000；一 抗Drp1，Abcam 公 司，1∶2000；一 抗Mfn1，Proteintech 公司，1∶2000；ATP 含量檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；大小鼠抓力儀（XR-YLS-13A，中國(guó)上海）；動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（EthoVision 3.1，Noldus，荷蘭）；AniRes2005 動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)（北京貝蘭博科技有限公司）。

1.3 COPD模型的建立

模型一（LPS 聯(lián)合煙熏組）：參照脂多糖滴入聯(lián)合煙熏建立COPD 大鼠模型[5-6]，第0、14 天氣管內(nèi)注入LPS 200 μl（1 g/L），從第1-84 天起，第14 天除外，上、下午分別將造模大鼠置于自制染毒箱內(nèi)被動(dòng)熏香煙，每周7 d，每天兩次，兩次間隔5 h以上，連續(xù)12周。

模型二（LPS 組）：參照劉君波[7]單純滴入LPS 建立COPD 大鼠模型的方法，將模型組大鼠麻醉后，用靜脈套管針向氣管內(nèi)注入LPS 200 ul（1 g/L），每周固定時(shí)間滴入1次，持續(xù)12周。

1.4 造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD 大鼠60 只，體重180～220 g，SPF 級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2006-0009。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)動(dòng)物房，屏障環(huán)境，環(huán)境溫度20～25℃，濕度50%～70%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分組，LPS 聯(lián)合煙熏組24只；LPS組24只；空白組12只。

1.5 體重測(cè)定及宏觀表征采集

每周固定時(shí)間測(cè)一次大鼠體重，觀察和記錄大鼠的宏觀表征包括一般狀態(tài)，舌、耳、唇、爪、毛和二便等多項(xiàng)癥狀體征，并進(jìn)行證候評(píng)價(jià)。宏觀表征采集量表是根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)》（2011版）虛證類證候療效判定標(biāo)準(zhǔn)制定，對(duì)每組大鼠進(jìn)行主觀描述和定性判斷。每次證候判斷為2個(gè)人同時(shí)進(jìn)行，互不干擾，宏觀表征采集表中主要包括大鼠精神狀態(tài)、活躍度、抓取反抗、自主活動(dòng)、身體蜷縮、目、舌、唇、鼻、爪、皮毛、大小便和呼吸等方面的觀察。

1.6 抓力測(cè)試

使用抓力測(cè)試儀，將大鼠前爪抓住抓力儀前部橫杠，抓穩(wěn)后向后拉，每只大鼠測(cè)3 次，取平均值為該次統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。大鼠若出現(xiàn)抓不穩(wěn)，或回頭及左右掙扎等，該數(shù)據(jù)不做記錄，重新測(cè)量。

1.7 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

100 cm × 100 cm × 40 cm 的黑色不透光敞箱，置在實(shí)驗(yàn)場(chǎng)中心，底部分出25 塊等大的正方形；敞箱頂部固定攝像頭，攝像頭的視野能覆蓋整個(gè)敞箱。將動(dòng)物放入正中央格后開始測(cè)定，每只動(dòng)物單獨(dú)計(jì)時(shí)6 min。分別在第1周、第8周和第12周測(cè)試一次。實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，用動(dòng)物行為分析系統(tǒng)分析攝像頭記錄的所有影像，并且分析行走總距離和行走平均速率相關(guān)的行為學(xué)指標(biāo)。

1.8 肺功能測(cè)定

將各組大鼠以2%戊巴比妥鈉80 mg/kg 腹腔注射麻醉，行氣管插管，仰臥于小動(dòng)物呼吸機(jī)的密閉體描箱內(nèi)，氣管插管與體描箱相連，觀察氣道壓力波形正常后，保證通路順暢后關(guān)閉體描箱，檢測(cè)大鼠吸氣總氣道阻力（RL）和動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（Cdyn）。

表1 1～12周各組大鼠體重比較（g；±s）

表1 1～12周各組大鼠體重比較（g；±s）

注：與空白組比較★P ＜0.05；與LPS組比較●P ＜0.05。

組別空白組LPS組LPS+煙熏組組別空白組LPS組LPS+煙熏組第1周N 12 24 24第7周N 12 11數(shù)值279.00±7.09 281.50±10.25 281.12±11.29數(shù)值320.58±13.80 312.04±33.98 309.13±25.70數(shù)值405.66±19.55 358.15±37.11★326.61±25.25★●數(shù)值453.33±21.10 404.91±17.99★336.78±23.00★●數(shù)值488.16±22.10 439.33±22.89★346.47±26.34★●數(shù)值507.33±21.22 460.81±26.95★366.52±27.50★●數(shù)值531.00±26.73 481.18±27.31★第2周N 12 15 22第8周N 12 9數(shù)值559.66±28.03 481.11±30.25★第3周N 12 12 19第9周N 12 8數(shù)值566.50±27.67 506.62±40.78★第4周N 12 12 19第10周N 12 8數(shù)值572.61±41.13 506.62±40.78★第5周N 12 12 19第11周N 12 8數(shù)值576.16±43.40 501.62±50.34★第6周N 12 11 19第12周N 12 7數(shù)值561.54±39.09 488.42±66.85★18 376.77±29.44★●18 399.88±31.78★●18 405.33±32.76★●18 410.72±37.38★●18 420.83±35.17★●18 421.33±37.07★●

1.9 病理切片處理與肺組織病理變化觀察

將大鼠右肺上葉用4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片HE 染色，觀察肺組織炎癥、細(xì)胞變性、纖維化和肺氣腫情況。

1.10 磷鉬酸比色法檢測(cè)肺、股四頭肌組織ATP含量

稱取肺、股四頭肌組織，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定ATP含量并計(jì)算：ATP（mmol/mgprot）=（測(cè)定A值-對(duì)照A 值）/（標(biāo)準(zhǔn)A 值-空白A 值）× 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（1 ×103μmol/L）× 樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù)/待測(cè)樣本蛋白質(zhì)量濃度（mgprot/mL）。

1.11 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

取大鼠右肺中葉和右腿骨骼肌進(jìn)行總蛋白提取，蛋白定量后檢測(cè)線粒體相關(guān)蛋白Mfn1、Drp1在肺和骨骼肌中各自的表達(dá)情況，判斷大鼠COPD 氣虛證模型下肺組織和骨骼肌中兩種蛋白表達(dá)含量的變化。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）的形式表示。根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，選用單因素方差分析（ANOVA）或非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重測(cè)量結(jié)果

造模后1-2 周，3 組相比，均無(wú)顯著差異；造模第3周起LPS 組、LPS 聯(lián)合煙熏組體重與空白組相比明顯下降（P＜0.05），LPS 聯(lián)合煙熏組體重下降更為明顯，且與LPS組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），并且持續(xù)到造模12周；結(jié)果見表1。

2.2 抓力測(cè)試結(jié)果

造模第1-8周，空白組、LPS組、LPS聯(lián)合煙熏組三組之間抓力平均值無(wú)顯著性差異；第12 周，LPS 聯(lián)合煙熏組較空白組和LPS組顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見表2；造模第1周，空白組、LPS組、LPS聯(lián)合煙熏組三組之間抓力最大值無(wú)顯著性差異；第8 周，LPS 聯(lián)合煙熏組最大值較空白組顯著降低（P＜0.05）；第12 周，LPS聯(lián)合煙熏組最大值較空白組和LPS 組顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見表3。

2.3 曠場(chǎng)結(jié)果

2.3.1 曠場(chǎng)總距離

造模前，各組大鼠曠場(chǎng)結(jié)果無(wú)明顯區(qū)別；造模第8周，LPS 聯(lián)合煙熏組大鼠行走總距離較空白組有明顯的下降（P＜0.05），LPS 組較LPS 聯(lián)合煙熏組和空白組行走總距離明顯上升（P＜0.05）；造模第12 周，LPS 聯(lián)合煙熏組較空白組和LPS 組行走總距離明顯下降（P＜0.05），結(jié)果見表4。

2.3.2 曠場(chǎng)平均速率

造模前，各組大鼠曠場(chǎng)結(jié)果無(wú)明顯區(qū)別；造模第8周，LPS 聯(lián)合煙熏組大鼠較空白組、LPS 組平均速率出現(xiàn)明顯的降低（P＜0.05），LPS 組和空白組平均速率無(wú)顯著性差異；第12周，LPS組和LPS聯(lián)合煙熏組平均速率較空白組均有明顯的下降（P＜0.05），LPS 聯(lián)合煙熏組較LPS組更為明顯（P＜0.05）；結(jié)果見表5。

2.4 證候判別結(jié)果

通過(guò)對(duì)每周宏觀表征采集表采集到的信息進(jìn)行分析，尤其對(duì)LPS聯(lián)合煙熏組大鼠的觀察，結(jié)合其它各項(xiàng)行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)造模第3 周LPS 聯(lián)合煙熏組大鼠開始出現(xiàn)明顯的體重增幅下降，LPS 組大鼠出現(xiàn)輕微體重增幅下降，辯證判斷兩組大鼠開始出現(xiàn)輕微氣虛證癥狀表現(xiàn)；造模第8 周LPS 聯(lián)合煙熏組在體重增幅降低的基礎(chǔ)上，同時(shí)表現(xiàn)出抓力大小、行走距離的下降，以及在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)密閉環(huán)境中行走總距離和平均速率的減少，辯證判斷LPS 聯(lián)合煙熏組部分大鼠出現(xiàn)較為明顯的氣虛證表現(xiàn)；造模第12 周末辨證判斷LPS 聯(lián)合煙熏組大部分大鼠出現(xiàn)典型氣虛證表現(xiàn)，同時(shí)LPS 聯(lián)合煙熏組大鼠的癥狀體征無(wú)緩解趨勢(shì)。LPS聯(lián)合煙熏組大鼠主要表現(xiàn)為精神狀態(tài)萎靡，活動(dòng)量顯著減少，抓取反抗較小，更換環(huán)境后無(wú)探索欲望，扎堆喜臥，極少聞及叫聲，移動(dòng)速度變慢等。

表2 各組大鼠三周抓力平均值比較（g；±s）

表2 各組大鼠三周抓力平均值比較（g；±s）

注：與空白組比較★P ＜0.05；與LPS組比較●P ＜0.05。

組別第1周第8周第12周數(shù)值1113.14±537.48 998.43±276.55 764.50±190.67★●空白組LPS組LPS+煙熏組N 12 24 24數(shù)值883.42±223.56 862.74±121.61 803.55±147.15 N 12 13 21數(shù)值1217.16±324.22 968.75±425.09 973.11±404.92 N 12 7 18

表3 各組大鼠三周抓力最大值比較（g；±s）

表3 各組大鼠三周抓力最大值比較（g；±s）

注：與空白組比較★P ＜0.05；與LPS組比較●P ＜0.05。

組別第1周第8周第12周數(shù)值7194.22±1202.03 7721.14±1136.61 5832.06±1642.20★●空白組LPS組LPS+煙熏組N 12 24 24數(shù)值5154.23±987.62 5071.23±1123.23 4987.52±782.45 N 12 13 21數(shù)值6912.66±1203.61 5722.00±1413.71 5057.22±1405.16★N 12 7 18

表4 各組大鼠曠場(chǎng)總距離比較（cm；±s）

表4 各組大鼠曠場(chǎng)總距離比較（cm；±s）

注：與空白組比較★P ＜0.05；與LPS組比較●P ＜0.05。

組別空白組LPS組LPS+煙熏組第1周第8周第12周數(shù)值1563.53±335.58 694.33±244.62★420.56±144.74★●N 12 24 24數(shù)值1776.53±258.56 1886.24±475.74 1881.05±449.22 N 12 13 21數(shù)值1578.74±850.70 1621.95±798.67★686.76±547.39★●N 12 7 19

表5 各組大鼠曠場(chǎng)平均速率比較（cm/s；±s）

表5 各組大鼠曠場(chǎng)平均速率比較（cm/s；±s）

注：與空白組比較★P ＜0.05；與LPS組比較●P ＜0.05。

組別第1周第8周第12周數(shù)值6.52±1.39 2.89±1.02★1.75±0.60★●空白組LPS組LPS+煙熏組N 12 24 24數(shù)值5.96±2.13 6.47±1.48 6.31±1.50 N 12 13 21數(shù)值7.75±2.36 6.66±2.59 2.47±1.76★●N 12 7 19

2.5 肺功能結(jié)果

造模第12 周，LPS 組肺阻力較空白組無(wú)顯著差異（P＜0.05），肺順應(yīng)性較空白組顯著降低（P＜0.05）；LPS 聯(lián)合煙熏組肺阻力較空白組、LPS 組出現(xiàn)顯著的升高（P＜0.05），肺順應(yīng)性較空白組、LPS 組出現(xiàn)顯著的降低（P＜0.05）；結(jié)果見表6。

2.6 病理結(jié)果

空白組切片見支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰，氣道黏膜上皮完整，纖毛排列整齊，肺泡大小均勻，見圖1A；LPS 聯(lián)合煙熏組和LPS 組則表現(xiàn)為支氣管黏膜上皮脫落，腺體增生，管壁有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；細(xì)支氣管痙攣，周圍平滑肌細(xì)胞增生，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肺大泡，小血管管壁增厚。此外，LPS 組（圖1B）細(xì)支氣管壁有時(shí)可見不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，主要表現(xiàn)為肺泡廣泛擴(kuò)大，肺泡間隔變薄及斷裂，而LPS 聯(lián)合煙熏組（圖1C）較LPS 組更常見氣道管壁及周圍，以及肺間質(zhì)內(nèi)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜皺襞增多更為明顯，突入管腔，導(dǎo)致管腔變窄或閉塞，腔內(nèi)可見黏液栓及炎性滲出。

表6 各組大鼠第12周肺功能比較（±s）

表6 各組大鼠第12周肺功能比較（±s）

注：與空白組比較★P ＜0.05；與LPS組比較●P ＜0.05。

肺順應(yīng)/(ml/cmH2O)0.741±0.173 0.642±0.165★0.479±0.006★●組別空白組LPS組LPS+煙熏組N 12 7 18肺阻力/(cmH2O.s/ml）0.564±0.231 0.814±0.564 2.109±0.088★●

表7 各組大鼠ATP含量檢測(cè)結(jié)果比較（mmol/mgprot；±s）

表7 各組大鼠ATP含量檢測(cè)結(jié)果比較（mmol/mgprot；±s）

注：與空白組比較★P ＜0.05；與LPS組比較●P ＜0.05。

骨骼肌426.27±96.76 287.92±81.06★163.15±36.08★●組別空白組LPS組LPS+煙熏組N 6 6 6肺88.05±23.15 25.07±8.23★23.54±13.86★

圖1 大鼠肺組織HE染色結(jié)果（×200）

圖2 肺組織中Drp1、Mfn1蛋白檢測(cè)結(jié)果

2.7 ATP含量檢測(cè)

ATP 含量檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS 組、LPS 聯(lián)合煙熏組大鼠肺組織ATP 含量較空白組有明顯的下降（P＜0.05），但LPS 組和LPS 聯(lián)合煙熏組肺組織ATP 含量無(wú)明顯差異（P＞0.05）；LPS組、LPS聯(lián)合煙熏組大鼠骨骼肌中ATP 含量較空白組、LPS 組均有明顯的下降（P＜0.05），LPS 聯(lián)合煙熏組骨骼肌中ATP 含量較LPS 組下降更為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；結(jié)果見表7。

2.8 免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）

Western blot 結(jié)果顯示，LPS 聯(lián)合煙熏組肺組織分裂蛋白Drp1 表達(dá)量較空白組和LPS 組明顯增高（P＜0.05）、融合蛋白顯著降低（P＜0.05），見圖2；LPS 聯(lián)合煙熏組骨骼肌分裂蛋白Drp1 表達(dá)量較空白組和LPS組出現(xiàn)明顯的增高（P＜0.05）、融合蛋白Mfn1 表達(dá)量則出現(xiàn)降低（P＜0.05），見圖3。

3 討論

圖3 骨骼肌組織中Drp1、Mfn1蛋白檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肺功能檢測(cè)和病理結(jié)果可以判斷大鼠是否處于COPD，綜合宏觀表征、體重、抓力、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可以判斷大鼠是否為氣虛證，從而確立COPD 氣虛證大鼠模型。COPD 存在多種造模方式，如宋一平[8]最早在國(guó)內(nèi)通過(guò)兩次氣管內(nèi)注入LPS（200μg/次）及熏香煙4 周的復(fù)合刺激法建立大鼠COPD 模型，解決了單純熏煙法難以復(fù)制出腺體增生肥大等重要病理表現(xiàn)的問(wèn)題，但這種方法造模時(shí)間太短，對(duì)是否能成模存在很大的爭(zhēng)議。李紅梅[9]等使用熏煙加LPS 和單純煙熏的方法，并將單純熏煙造模時(shí)間延長(zhǎng)至3個(gè)月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙熏聯(lián)合LPS 組更符合COPD 死亡患者尸檢病理改變，單純煙熏組雖有類似病理改變，但是其程度甚至低于煙熏聯(lián)合LPS 28 天造模后大鼠的病理改變，可見單純煙熏不僅造模慢，而且效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如煙熏聯(lián)合LPS。劉君波[7]等通過(guò)氣管內(nèi)反復(fù)滴入LPS 8周建立大鼠COPD 模型，之后方蘇榕[10]通過(guò)復(fù)制和比較90 天香煙煙熏加氣管內(nèi)注入LPS、單獨(dú)香煙煙熏及單獨(dú)氣道內(nèi)注入LPS 3 種方法，發(fā)現(xiàn)煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴入LPS的方法更為符合人類COPD 特征變化。另外，李建生等[11]采用肺炎克雷伯桿菌滴鼻的方法連續(xù)滴鼻16 周后制備COPD 急性加重期大鼠模型。文文等[12]采用銅綠假單胞菌反復(fù)感染大鼠氣道的方式可致大鼠產(chǎn)生COPD的病理學(xué)改變，以及蛋白水解酶誘導(dǎo)的COPD模型、基因調(diào)控COPD 模型等[13]。考慮到吸煙是導(dǎo)致人類COPD 和其他呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的最重要因素之一[14]，煙熏聯(lián)合LPS造模方法符合人類COPD病理變化，而單純LPS 滴入誘導(dǎo)的COPD 模型是在短時(shí)間內(nèi)造成肺及氣管的損傷，相較于LPS 聯(lián)合煙熏制備的COPD 大鼠模型，該模型可作為單純因素疾病模型，對(duì)于研究COPD 大鼠證候變化和機(jī)制區(qū)別具有重要的對(duì)比意義；另外氣虛證多存在于COPD 穩(wěn)定期，細(xì)菌感染型建立的動(dòng)物模型多處于COPD 急性加重期[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們選擇單純滴入LPS 和LPS 滴入聯(lián)合煙熏兩種COPD 疾病造模模型，動(dòng)態(tài)觀察12 周，研究COPD 大鼠模型疾病發(fā)生發(fā)展及證侯變化，通過(guò)對(duì)比兩組大鼠第12 周病理結(jié)果和肺功能發(fā)現(xiàn)兩種造模方法在第12 周均可以建立COPD 大鼠模型，LPS 聯(lián)合煙熏組模型較LPS組更為典型。

基于本課題組前期對(duì)血瘀證動(dòng)物模型的研究經(jīng)驗(yàn)[16-17]和臨床上COPD 氣虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)和指標(biāo)，課題組制作了COPD 氣虛證大鼠模型的等效指標(biāo)轉(zhuǎn)換表和宏觀表征采集表，并對(duì)COPD 其它證型的判斷和鑒別制定了標(biāo)準(zhǔn)。在中醫(yī)理論中，慢阻肺氣虛證主要包括肺氣虛、肺脾氣虛和肺腎氣虛，課題組將三種證候的共同癥狀歸納為主癥和次癥，主癥包括神疲乏力、氣短懶言、喘息和動(dòng)輒加重；次癥包括惡風(fēng)自汗、舌淡苔白或有齒痕，脈沉虛。通過(guò)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠實(shí)際情況的觀察，將氣虛證共同癥狀等效轉(zhuǎn)換為呼吸頻率、呼吸幅度、自主活動(dòng)、體重變化、抓取反抗、抓力測(cè)試、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行進(jìn)總距離和平均速率等實(shí)際可觀察的指標(biāo)，滿足等效指標(biāo)三種及以上的情況，即認(rèn)為氣虛證成立，以判斷病證結(jié)合模型是否建立成功。通過(guò)對(duì)各組大鼠12 周各項(xiàng)數(shù)據(jù)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：LPS 聯(lián)合煙熏組在第8 周時(shí)，體重、曠場(chǎng)和抓力測(cè)試結(jié)果較空白組和LPS 組都有明顯的氣虛證特征性改變；宏觀表征采集表結(jié)果顯示LPS聯(lián)合煙熏組大鼠不僅有活動(dòng)量和體質(zhì)量增幅的減少，而且表現(xiàn)出蜷縮拱背、行動(dòng)遲緩、神疲乏力、抓取反抗無(wú)力、毛失光澤、發(fā)黃、易脫落，偶可聞及呼吸道痰鳴音等表現(xiàn)，這些表現(xiàn)很大程度上符合中醫(yī)理論對(duì)于氣虛證的定義。到第12周時(shí)，這些癥狀更加明顯，結(jié)合肺功能和HE 染色結(jié)果，我們可以判斷LPS 聯(lián)合煙熏組的大鼠模型不僅有COPD 的病理表現(xiàn)，而且兼具氣虛證的中醫(yī)證型表現(xiàn)。

建立COPD 氣虛證大鼠模型后，本課題組進(jìn)一步對(duì)大鼠肺和骨骼肌組織中ATP 含量和分裂蛋白Drp1、融合蛋白Mfn1蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，探索兩種指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果對(duì)評(píng)價(jià)慢阻肺氣虛證大鼠模型建立成功的指導(dǎo)意義。COPD 的發(fā)生發(fā)展與肺部和氣道炎癥密切相關(guān)，且COPD 患者肌力明顯下降與體內(nèi)炎癥、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激等因素相關(guān)[18]。研究顯示，炎癥因子大量增多不僅可以改變細(xì)胞的生理狀態(tài)，而且可以影響線粒體的融合與分裂[19]。線粒體的融合分裂過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能有著重要作用，其能針對(duì)細(xì)胞的能量需求、損傷情況等作出相應(yīng)的變化，如線粒體片段化或者延長(zhǎng)。其異常可導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病。融合蛋白[20]Mfn1 和分裂蛋白Drp1 作為其中的關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞中不僅發(fā)揮著調(diào)控線粒體分裂、融合的正常功能，當(dāng)其失去平衡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體片段化，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，線粒體嵴發(fā)生重構(gòu)，而線粒體形態(tài)對(duì)于細(xì)胞維持正常生理代謝和機(jī)體發(fā)育起著重要的作用，一旦出現(xiàn)障礙會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病[21]。同時(shí)，線粒體作為生物氧化和能量代謝的主要場(chǎng)所，它能夠進(jìn)行物質(zhì)的氧化磷酸化反應(yīng)以及合成ATP，為機(jī)體提供95%以上的能量[22]。通過(guò)對(duì)兩組COPD 模型大鼠肺和骨骼肌中ATP 含量和Drp1、Mfn1 蛋白表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)第12周LPS聯(lián)合煙熏組肺和骨骼肌中ATP含量較LPS組和空白組均有明顯的下降；兩組COPD 模型大鼠肺和骨骼肌中Drp1、Mfn1蛋白表達(dá)較空白組出現(xiàn)失衡的情況，其中LPS聯(lián)合煙熏組與空白組相比變化最為明顯，主要表現(xiàn)為Drp1 蛋白增多和Mfn1 蛋白減少，兩項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果符合我們對(duì)COPD 疾病影響線粒體分裂、融合蛋白平衡和ATP 能量代謝的理論。同時(shí)本課題組認(rèn)為L(zhǎng)PS 聯(lián)合煙熏組Drp1、Mfn1 蛋白表達(dá)和ATP含量變化極有可能是導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)氣虛證癥狀的內(nèi)部機(jī)制因素，這種變化不僅反映著大鼠體內(nèi)線粒體能量代謝異常，同時(shí)提示研究者該變化可能與COPD 模型大鼠證候變化有著密切的關(guān)系，因此可以作為慢阻肺氣虛證大鼠建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

總之，證候模型的評(píng)價(jià)應(yīng)是系統(tǒng)性的評(píng)價(jià)體現(xiàn)，而非某個(gè)指標(biāo)可以界定，通過(guò)四診結(jié)合辨別病證是中醫(yī)學(xué)辨證論治的基礎(chǔ)，基于擬臨床研究的證候模型評(píng)價(jià)有必要構(gòu)建“四診合參”系統(tǒng)性的評(píng)價(jià)體系[23]。基于此，本研究將臨床上對(duì)COPD 氣虛證患者的診斷指標(biāo)等效轉(zhuǎn)換為在LPS聯(lián)合煙熏大鼠上可以觀察和檢測(cè)到的指標(biāo)，如將大鼠的精神狀態(tài)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)作為“神疲”的評(píng)價(jià)指標(biāo)；自主活動(dòng)降低與抓力大小作為“乏力”的評(píng)價(jià)指標(biāo)；體質(zhì)量變化作為“食少懶言”的評(píng)價(jià)指標(biāo)；Drp1、Mfn1 蛋白表達(dá)失衡和ATP 含量下降作為生物學(xué)基礎(chǔ)方面評(píng)價(jià)指標(biāo)，并判定第12 周結(jié)束LPS聯(lián)合煙熏COPD 大鼠符合COPD 氣虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)，但COPD 氣虛證演變規(guī)律仍需進(jìn)一步的探索和證據(jù)確認(rèn)。另外，COPD 患者不同臟腑虛損在骨骼肌含量上表現(xiàn)不同，具體機(jī)制仍待探討[24]，而本研究中COPD 大鼠不同組織線粒體功能變化不同，線粒體分裂融合蛋白表達(dá)含量對(duì)COPD 大鼠線粒體功能障礙的研究也許能為COPD 骨骼肌功能障礙提供一種思路。COPD 氣虛證大鼠模型建立成功對(duì)研究COPD 疾病和氣虛證機(jī)制研究具有重要的意義，而合理、規(guī)范、科學(xué)的評(píng)價(jià)體系對(duì)于模型的建立同樣非常重要，本研究通過(guò)建立和評(píng)價(jià)COPD 氣虛證大鼠模型可以為研究COPD 科研人員提供一種可行的方法，并對(duì)臨床用藥和新藥開發(fā)提供一種可行的思路。