基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的忍冬藤抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機制研究＊

郭思琦，姜春燕，張百霞＊＊

（1. 河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 保定 071002；2. 中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院 南京 211198）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種病因未明的以滑膜炎和血管翳為主、以對稱性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性的慢性自身免疫功能障礙性疾病[1]。RA 在我國發(fā)病率約為0.32%-0.37%，多見于中年女性[2]。RA 不但影響身體的運動系統(tǒng)，還會累及心臟、腎臟、呼吸等系統(tǒng)，嚴(yán)重影響人們的正常生活和工作[3]。

根據(jù)RA 的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸為“痹癥”。痹癥主要由于風(fēng)寒濕等邪毒侵入，引起經(jīng)絡(luò)阻塞，氣血不暢所致。藤類藥物有通經(jīng)入絡(luò)功效，常用于臨床治療多種風(fēng)寒濕痹。忍冬藤為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥莖枝，味甘、寒，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒，疏風(fēng)通絡(luò)的功效[4]。《本草綱目》記載忍冬藤“治一切風(fēng)濕氣及諸腫痛”，《履巉巖本草》記載忍冬藤“治筋骨疼痛”。現(xiàn)代數(shù)據(jù)統(tǒng)計和挖掘分析表明，忍冬藤為醫(yī)家治療RA 的常用藥物。如分別對國醫(yī)大師劉祖貽[5]、馬文輝[6]、王慶國教授[7]治療RA 臨床經(jīng)驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)三位醫(yī)家治療RA 的高頻次藥味均包含忍冬藤。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，忍冬藤被廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕、類風(fēng)濕和痛風(fēng)等疾病的治療[8-10]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，是從生物網(wǎng)絡(luò)的角度研究疾病的發(fā)生發(fā)展過程、認(rèn)識藥物與機體的相互作用，并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)的學(xué)科[11-12]。其基本思想是研究疾病狀態(tài)下的生物網(wǎng)絡(luò)，而非與疾病相關(guān)的個別基因或蛋白，從而達到綜合的防治效果。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法能夠從中藥調(diào)控的整體生物網(wǎng)絡(luò)層面進行分析，融合了海量的生物學(xué)和中醫(yī)藥領(lǐng)域的數(shù)據(jù)和技術(shù)，并利用網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)，同時具有快速高效的特點，因此該方法被越來越廣泛的應(yīng)用到中藥作用機理解析中[13-15]。目前，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討RA 的發(fā)病機制已有大量研究，但忍冬藤治療RA 的作用機制還未見系統(tǒng)解析與報道。本研究基于實體語法系統(tǒng)，構(gòu)建忍冬藤治療RA 的生物網(wǎng)絡(luò)，以推斷化學(xué)成分作用靶點與RA 相關(guān)靶點蛋白的作用關(guān)系，從而辨識忍冬藤治療RA 的有效成分，解析忍冬藤治療RA的作用機制。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

忍冬藤的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)：來源于TCMSP 數(shù)據(jù)庫和TCMD 數(shù)據(jù)庫，以藥代動力學(xué)（ADME）參數(shù)確定藥物口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18為篩選條件，篩選化學(xué)成分。并利用CNKI 和PubMed 中的文獻（1979-2019 年）進行補充。利用Chemical Book、愛化學(xué)數(shù)據(jù)庫對所得化學(xué)成分名稱進行規(guī)范，共得到化學(xué)成分54個。

化學(xué)成分作用靶點蛋白數(shù)據(jù)：來源于Stitch 5.0（http://stitch.embl.de./），以化學(xué)成分名稱為檢索條件，置信度為0.400，數(shù)據(jù)來源于文本挖掘、共表達、基因融合等8種方法。

RA 相關(guān)靶點數(shù)據(jù)：來源于GAD 數(shù)據(jù)庫，共得到185個疾病靶點。

生物學(xué)反應(yīng)及信號通路數(shù)據(jù)：來源于Reactome 數(shù)據(jù)庫（http://www.reactome.org）。Reactome 包含了人類的6792 個復(fù)合物、7327 個蛋白質(zhì)，共1522 個生物學(xué)反應(yīng)、7075 個反應(yīng)以及各種生物分子的亞細胞定位信息。本課題組前期通過對原始下載數(shù)據(jù)的提取，得到了用于建立模型的數(shù)據(jù)，包括蛋白質(zhì)、大分子復(fù)合物、小分子和生化反應(yīng)的編號和名稱。

小分子代謝數(shù)據(jù)：來源于文獻“The Edinburgh human metabolic network reconstruction and its functional analysis”[16]，該文獻提供的數(shù)據(jù)收集了KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）[17]和HumanCyc（http://www.humancyc.org/）[18]數(shù)據(jù)庫中的小分子代謝反應(yīng)的相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2 基于實體語法系統(tǒng)的“忍冬藤化學(xué)成分-化學(xué)成分靶點-RA疾病靶點”生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

實體語法系統(tǒng)（Entity Grammar System，EGS）是針對復(fù)雜系統(tǒng)建模提出的一種形式化語法系統(tǒng)，可用來描述復(fù)雜系統(tǒng)的組成單位、組織方式和變化規(guī)律[19]。EGS用五元組G=（VN,VT,F,P,S）表示，其中各項分別表示非末端字符集，末端字符集，操作子集，規(guī)則集，初始字符。當(dāng)不考慮或者不區(qū)分末端字符與非末端字符時，用四元組G=（V,F,P,S）表示，其中V=VN∪VT。操作子集F 的每一個元素表示字符的組織方式，字符采用這種組織方式所形成的單元E（V, F）叫實體。四元組分別對應(yīng)于復(fù)雜系統(tǒng)建模的四個方面，即基本組成單位、復(fù)雜系統(tǒng)中的基本結(jié)構(gòu)、由結(jié)構(gòu)所組成的實體轉(zhuǎn)換規(guī)則以及由基本組成單位按照結(jié)構(gòu)類型組成的特定實體。實體語法系統(tǒng)可以由特定的實體出發(fā)，根據(jù)特定的轉(zhuǎn)換規(guī)則進行推演得到新的實體。

本研究將實體語法系統(tǒng)用于忍冬藤化學(xué)成分靶點，作用于RA 相關(guān)靶點的生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和中藥作用效應(yīng)在背景網(wǎng)絡(luò)中的傳遞和推演，V 主要包含組成忍冬藤作用生物網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點類型，包括中藥化學(xué)成分及其作用靶點，疾病名稱以及相關(guān)蛋白靶點，復(fù)雜小分子和蛋白等；F 包括網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點關(guān)系類型以及為后續(xù)推斷過程所準(zhǔn)備的虛擬實體類型；P 所包含的規(guī)則用于忍冬藤作用靶點與RA疾病靶點關(guān)系的推斷；F包括網(wǎng)絡(luò)中的各種節(jié)點關(guān)系類型（interaction，neg，pos 等），通過以上原理來進行忍冬藤作用機理的解析。推理規(guī)則如下：

1.3 網(wǎng)絡(luò)可視化

Cytoscape 是一個基于Java 技術(shù)的開放源代碼的網(wǎng)絡(luò)可視化軟件平臺，主要用于復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析[20]。本研究利用Cytoscape 3.7.1 繪制生物網(wǎng)絡(luò)圖，展示forward(C,D,F,M)中的生物分子。在生物網(wǎng)絡(luò)中，“節(jié)點（node）”表示化學(xué)成分、靶蛋白、以及其他小分子，“邊（edge）”表示化學(xué)成分與靶點之間的關(guān)系。

表1 忍冬藤治療RA的有效成分

1.4 拓撲結(jié)構(gòu)分析

網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)用于表示整個網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)外觀，反映各結(jié)點之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系。本研究利用Cytoscape

3.7.1 軟件中CytoNCA 插件進行拓撲結(jié)構(gòu)分析，以degree 值、betweenness 值、closeness 值大于其平均值的節(jié)點為指標(biāo)進行篩選，得出網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點，即忍冬藤治療RA的關(guān)鍵作用靶點。

1.5 網(wǎng)絡(luò)富集分析

David是一種整合多種數(shù)據(jù)庫資源的數(shù)據(jù)庫，運用改良的Fisher精確檢驗算法實現(xiàn)對基因集的富集分析。本研究利用DAVID 6.7 Functional Annotation Clustering中Gene Ontology 的分子功能條目對關(guān)鍵蛋白的生物過程（BP）進行KEGG 通路富集分析[21]。選擇P＜0.05和FDR ＜0.05的條目作為顯著富集的通路，即忍冬藤治療RA的生物通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 忍冬藤化學(xué)成分作用于RA相關(guān)靶點的生物網(wǎng)絡(luò)

本研究建立了忍冬藤、RA 相互作用的生物網(wǎng)絡(luò)，以忍冬藤中所有化學(xué)成分為起點，RA 為終點，將忍冬藤的化學(xué)成分與RA 的相關(guān)蛋白連接，深入探討忍冬藤抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機制，忍冬藤化學(xué)成分作用于RA 相關(guān)靶點的生物網(wǎng)絡(luò)（見圖1），共包括2 289 個節(jié)點和5 278 條邊。生物網(wǎng)絡(luò)中，紅色菱形代表忍冬藤治療RA 的有效化學(xué)成分，包括：木樨草素、綠原酸、蘆丁、芳樟醇、棕櫚酸、丁香酸、槲皮素等31 個化學(xué)成分；綠色圓形代表化學(xué)成分的靶點蛋白；藍色正方形代表網(wǎng)絡(luò)中的小分子復(fù)合物；橙色三角形代表網(wǎng)絡(luò)中的小分子；黃色平行四邊形代表生物化學(xué)途徑。灰色的邊代表忍冬藤中某化學(xué)成分對其相關(guān)靶點為促進作用，黑色的邊代表抑制作用，粉色的邊代表未知的相互作用關(guān)系。

2.2 忍冬藤治療RA的有效成分

將生物網(wǎng)絡(luò)中能通過一條或多條生物途徑作用到RA相關(guān)靶點的化學(xué)成分作為忍冬藤治療RA的有效成分，最終得到包括木樨草素、綠原酸、蘆丁、芳樟醇、棕櫚酸、丁香酸、槲皮素等在內(nèi)的31個有效成分（見表1）。

木樨草素[22]和咖啡酸[23]均具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、影響炎癥反應(yīng)及調(diào)控細胞生長，在控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病程進展中發(fā)揮抗炎、抗免疫作用，減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎惡化；Li等[24]曾建立膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型，得出芹菜素可通過抑制滑膜增生、血管生成和破骨細胞生成來抑制CIA，從而實現(xiàn)對RA 的保護作用；蘆丁可通過抑制NF-κB 信號通路降低氧化應(yīng)激和促炎細胞因子，從而抗RA[25]。槲皮素可減少RA 軟骨細胞基質(zhì)降解和細胞凋亡，可抗骨內(nèi)細胞衰老，從而預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)破壞，在多種關(guān)節(jié)疾病中均有保護和治療作用[]。丹皮酚具有明顯的抑制滑膜組織炎癥反應(yīng)和RA 進展的作用，潛在機制可能是 通 過 衰 減TLR4-NF-κB 激 活 實 現(xiàn)[29]。Somaiya Mateen等[30]發(fā)現(xiàn)外周血單個核細胞（PBMC）培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)丁香酚對RA患者的PBMC培養(yǎng)具有明顯的抗炎、抗氧化作用。由此可見，本研究得到的忍冬藤抗RA 的有效成分具有一定可靠性。

2.3 忍冬藤治療RA的關(guān)鍵疾病靶點

利用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲結(jié)構(gòu)分析，取Degree 值、Betweenness 值、Closeness 值大于其平均值的節(jié)點，包括CYP17A1、CYP8B1、POMC、CYP19A1、

AKT1、 CYP1B1、 MAPK1、 AKR1B1、 JUN、 SP1、BHLHE39、CYP1A1、PPARA 共計13 個，為忍冬藤治療RA的關(guān)鍵靶點（見表2）。

圖1 忍冬藤化學(xué)成分作用于RA相關(guān)靶點的生物網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，本研究得到的13個忍冬藤治療RA 的關(guān)鍵靶點蛋白均與RA 有關(guān)。例如，腦內(nèi)p-內(nèi)啡肽在中樞中分布廣泛，具有較強的嗎啡樣活性，對RA有較強的鎮(zhèn)痛作用。POMC（阿黑皮素原）為腦內(nèi)p-內(nèi)啡肽的前體物質(zhì)，因此POMC 表達水平越高則鎮(zhèn)痛效果愈加顯著[31]。另外，RA 是一種自身免疫疾病[32]，促腎上腺皮質(zhì)激素是一種可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中大多數(shù)細胞，對神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)均有調(diào)節(jié)作用的激素，POMC 是促腎上腺皮質(zhì)激素的前體物質(zhì)，因此POMC表達水平越高則免疫調(diào)節(jié)能力越好。破骨細胞是導(dǎo)致RA骨破壞的主要原因之一[33]，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路活化是破骨細胞形成的關(guān)鍵通路[34]，抑制p38 MAPK信號通路可減少破骨細胞分化，減輕動物實驗性關(guān)節(jié)炎進程和關(guān)節(jié)損傷[35]。綜上所述，本研究得到的忍冬藤抗RA的關(guān)鍵靶點具有一定可靠性。

2.4 忍冬藤治療RA的關(guān)鍵通路分析

本研究對表2 中13 個關(guān)鍵靶點進行富集分析，共得到55條通路（見表3）。

表2 忍冬藤治療RA的關(guān)鍵靶點蛋白

富集分析所得生物通路大致可分為：激素調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝調(diào)控、細胞周期及凋亡調(diào)控、促肝臟發(fā)育四方面。從動物、人類流行病學(xué)統(tǒng)計的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，RA 發(fā)病高峰期與絕經(jīng)期相吻合，這提示雌激素缺乏可能是RA 的發(fā)病原因之一[36]。實驗研究表明，接受卵巢切除（OVX）降低雌激素水平的小鼠，與接受雌激素治療的OVX 小鼠或者未接受OVX 的正常雌激素水平小鼠相比，關(guān)節(jié)炎發(fā)生率高且病情更嚴(yán)重[37]。早在十五年之前，便有研究發(fā)現(xiàn)激素替代療法可減少紅細胞沉降率、血清血紅蛋白水平升高、增加骨密度，使關(guān)節(jié)糜爛進展減慢，臨床療效改善，同樣證明激素水平在RA 病程中必須給予關(guān)注[38]；另有臨床研究表明，雌激素可在一定程度上抑制破骨細胞活性，促進成骨細胞增殖[39]。綜合上文可知，本研究通過富集分析所得激素的調(diào)節(jié)、代謝相關(guān)通路GO：0034754、GO：0042445、GO：0010817、GO：0009725可能是忍冬藤治療RA的生物通路。

Andonian Brian J等[40]發(fā)現(xiàn)，肥胖或超重的RA患者比體重正常的RA 患者滑膜炎更嚴(yán)重；Ferguson Lyn D等[41]以腰圍為指標(biāo)評判中心性肥胖與RA的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)中心性肥胖會增加RA 患病率。脂質(zhì)攝入過多會導(dǎo)致肥胖、脂肪酸代謝途徑、類固醇的代謝過程均會調(diào)控肥胖，從而影響RA 發(fā)病率。由此可知，類固醇代謝過程（GO:0008202）、對脂多糖的反應(yīng)（GO:0032496）、脂肪酸-氧化的調(diào)節(jié)（GO:0031998）、調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解代謝過程（GO:0050994）、脂肪酸氧化的調(diào)節(jié)（GO:0046320）、脂類生物合成的過程（GO:0008610）、脂質(zhì)代謝過程的正向調(diào)控（GO:0045834）、脂肪酸代謝過程的調(diào)節(jié)（GO:0019217）均為忍冬藤治療RA的關(guān)鍵生物途徑。

RA 屬風(fēng)濕痹癥，系肝腎虧虛、精血不足、筋骨失養(yǎng)所致。根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)藏象學(xué)說，肝主疏泄、主藏血，包括肝、膽等臟器[42]。另外，肝臟化學(xué)成分異常、肝纖維化經(jīng)常出現(xiàn)在RA 病程中。因此，肝臟發(fā)育（RAGO:0001889）是忍冬藤治療RA的一條潛在的生物途徑。

RA 為慢性疾病，發(fā)病時伴有關(guān)節(jié)損傷和骨質(zhì)破壞，在RA 的病程中，破骨細胞分化和破骨細胞相關(guān)蛋白的上調(diào)會導(dǎo)致關(guān)節(jié)被侵襲和破壞[43]。可分化為破骨細胞的前體包含單核細胞、巨噬細胞、DCs（不成熟樹突狀細胞）及MDSCs（骨髓來源的抑制性細胞），而細胞分化涉及基因表達、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等過程，因此細胞生物合成過程的正向調(diào)控（GO：0031328）、蛋白質(zhì)運 輸（GO：0017038）、基 因 表 達 的 正 調(diào) 控（GO：0010628）可能是忍冬藤治療RA的相關(guān)生物通路。

有研究[44]發(fā)現(xiàn)，miRNA 的異常表達與滑膜細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，參與RA 炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、敏感性和骨破壞，調(diào)控細胞信號通路和細胞外基質(zhì)降解，是RA 的潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點。因此，細胞凋亡的正向調(diào)控（GO：0043065）、細胞死亡的正調(diào)控（GO：0010942）也可能是忍冬藤治療RA 的生物通路。

綜上所述，已有相關(guān)報道的和RA 相關(guān)的生物通路共涉及四個方面，說明忍冬藤可通過48條生物通路治療RA。目前，本研究還不能確定其他7條生物通路是否是忍冬藤治療RA的生物通路。

3 結(jié)論與展望

忍冬藤是治療風(fēng)濕痹癥、抗RA 的臨床常用藥，本研究基于“實體語法系統(tǒng)”構(gòu)建忍冬藤抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎生物網(wǎng)絡(luò)，探討忍冬藤抗RA 的有效成分和作用機制。不同于蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)[45]，本研究所構(gòu)建的生物網(wǎng)絡(luò)包含蛋白、基因、小分子代謝物等人體內(nèi)所有小分子類型，使網(wǎng)絡(luò)模型具有更高的仿真能力。

本研究通過對忍冬藤抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎生物網(wǎng)絡(luò)的分析，辨識出忍冬藤抗RA的31個有效成分，包括木樨草素、芹菜素、蘆丁、槲皮素、丁香酸等。忍冬藤的31 個 有 效 成 分 作 用 于CYP17A1、CYP8B1、POMC、CYP19A1 和AKT1 等13 個關(guān)鍵靶點，通過以下五點發(fā)揮作用：①激素調(diào)節(jié)影響破骨細胞的活性；②脂質(zhì)、脂肪酸代謝途徑影響體脂率；③調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯過程影響細胞分化成破骨細胞；④調(diào)控RNA的表達和細胞凋亡，影響免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)；⑤調(diào)節(jié)肝臟發(fā)育，從而發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。

通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，大部分有效成分具有抗RA作用，大部分生物通路為忍冬藤治療RA 的生物通路，這說明基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討忍冬藤抗RA 的有效成分及作用機制具有可靠性。但是，有些化學(xué)成分的抗RA作用以及少部分生物途徑（如GO:0055114、GO:0010557）是否和RA相關(guān)還未見報道。

隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)和數(shù)據(jù)庫的發(fā)展，本研究將構(gòu)建包含機體內(nèi)所有生物分子類型的動態(tài)生物網(wǎng)絡(luò)，提高生物網(wǎng)絡(luò)的仿真能力。本課題組將進一步驗證本次研究得到的有效成分是否為忍冬藤抗RA 的有效成分，為抗RA 的新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)；將明確7 條生物通路是否是忍冬藤治療RA 的生物通路，為RA 發(fā)病機制研究提供依據(jù)。