龍眼Myb-related-R1的克隆及生物信息學(xué)分析

李浩然 徐炯志 潘介春 王穎 李琳 王金英 黃幸 譚春露 鄧英毅

摘 要：目的：以龍眼成熟葉片為試驗(yàn)材料，研究Myb-related基因在龍眼中的表達(dá)情況，初步推出側(cè)該基因的功能。方法：通過轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析得到龍眼Myb-related R1基因全長序列，進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異引物對其開放閱讀框（ORF）全長序列進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析。結(jié)果：Myb-related-R1基因與SANT超家族基因片段有相似之處，ORF長度為879bp，編碼292個(gè)氨基酸，有1個(gè)Myb結(jié)合位點(diǎn)。該蛋白屬于非跨膜親水蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測定位于細(xì)胞核，存在35個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)。其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果高度一致，同源基因進(jìn)化樹分析表明，該基因與阿月渾子蛋白組親緣關(guān)系最近。結(jié)論：根據(jù)其他物種該基因的功能及生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果，可初步推測該基因功能與染色體端粒結(jié)構(gòu)有關(guān)，且與花青素合成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：龍眼;基因克隆;Myb-related-R1;端粒

中圖分類號 S667.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）09-0012-06

Cloning and Bioinformatics Analysis of Myb-related-R1 in Longan

Li Haoran et al.

（1Collegeof Agriculture，Guangxi University，Nanning 530004， China）

Abstract： Objective： the Myb-related gene family has different functions in plants.In this study， the expression of this gene in the mature leaves of longan was studied， and the function of this gene was derived.Methods： the full-length sequence of longan Myb-related-R1 gene was obtained by transcriptome sequencing and bioinformatics analysis， and further specific primers were designed for cloning and bioinformatics analysis of the full-length sequence of open reading frame （ORF）.Results： the Myb-related-R1 gene is similar to the SANT superfamily gene fragment.The length of ORF is 879bp， encoding 292 amino acids， and there is a Myb binding site.This protein belongs to non-transmembrane hydrophilic protein， which is located in the nucleus by subcellular localization prediction and has 35 amino acid phosphorylation sites.The secondary structure was mainly composed of ml-helix and irregular curl， and the predicted results of the secondary structure and tertiary structure were highly consistent.Conclusion： according to the function of this gene in other species and the prediction results of bioinformatics software， it can be preliminarily speculated that the function of this gene is related to telomeres and anthocyanin synthesis.

Key words： Longan;Gene cloning ; Myb-related-R1;Telomeres

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是我國南方果樹，俗稱桂圓，是廣西地區(qū)主要栽培的果樹種類之一[1-2]。因品種結(jié)構(gòu)不合理，導(dǎo)致國內(nèi)龍眼產(chǎn)期集中、大小年明顯等問題凸顯，使我國龍眼產(chǎn)業(yè)在國際競爭中處于劣勢。為了有效調(diào)節(jié)龍眼產(chǎn)期，提高生產(chǎn)效益，許多學(xué)者開展了龍眼成花機(jī)理、產(chǎn)期調(diào)節(jié)技術(shù)研究及其優(yōu)良品種的選育[3]，對龍眼成花分子生物學(xué)的研究逐步成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。

目前，已有大量的Myb-related基因從植物中分離出來，但只有少數(shù)基因的功能為人所知。在玉米中，有3種Myb-related基因（Cl、Pl和P）是黃酮類化合物和衍生色素形成所必需的[4-5]。花青素是植物的二級代謝產(chǎn)物[6]，是構(gòu)成花瓣和果實(shí)顏色的主要色素之一，RVE8可以直接與花青素生物合成中所涉及的啟動子基因相關(guān)聯(lián)，并在響應(yīng)晝夜變化過程中調(diào)控這些基因的表達(dá)，RVE被認(rèn)為是植物中花青素生物合成的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子[5，7]，而且花瓣和果實(shí)的顏色可吸引動物進(jìn)行授粉和種子傳播，對植物成花及結(jié)果起著重要作用。可見，Myb-related-R1基因與植物色素的合成及開花等功能具有緊密聯(lián)系。

植物轉(zhuǎn)錄因子MYB是近年來發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)錄因子，與調(diào)控植物生長發(fā)育、生理代謝、細(xì)胞的形態(tài)和模式建成等生理過程有關(guān)，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄組家族之一[7]。大多數(shù)MYB蛋白在N端含有一段特定的氨基酸殘基組成的MYB結(jié)構(gòu)域，根據(jù)這個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征，可將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為以下4個(gè)亞類：1R-MYB/Myb-related;R2R3-MYB;3R-MYB;4R-MYB（4個(gè)R1/R2的重復(fù)）。Myb-related（1R-MYB）類基因家族為本研究的主要內(nèi)容。只含1個(gè)R結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄因子亞類，單一R結(jié)構(gòu)的MYB蛋白可存在于肽鏈的兩端或中間，該類蛋白是重要的端粒結(jié)合蛋白，其主要作用是集中維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，但在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程也發(fā)揮一定的作用[9]。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹將Myb-related基因家族分為以下5個(gè)高度保守的亞家族：CCA1-like/R-R、TBP-like、CPC-like、I-box-like和TRF-like;各亞家族的結(jié)構(gòu)非常保守。其中TRF-like亞家族數(shù)量非常之少，說明它們在進(jìn)化過程中非常保守。

干旱是影響植物生長和生理的主要環(huán)境脅迫因子之一，相應(yīng)地，為應(yīng)答干旱脅迫，植物會啟動一系列應(yīng)答機(jī)制來抵御外界環(huán)境因子。玉米Myb-related基因的表達(dá)水平在耐旱品種和非耐旱品種間存在差異，它們的表達(dá)譜很相似。其中，4個(gè)CCA1/R-like基因（ZmMYBR19，ZmMYBR28，ZmMYBR49，和ZmMYBR56），1個(gè)TRF-like基因（ZmMYBR41）和6個(gè)TBP-like基因（ZmMYBR07，ZmMYBR26，ZmMYBR31，ZmMYBR45，ZmMYBR47和ZmMYBR55）的表達(dá)明顯受到干旱的誘導(dǎo)，說明它們可能參與植物抗旱脅迫的應(yīng)答。本研究從龍眼中獲得Myb-related-R1基因，并通過生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步了解該基因理化特性，為進(jìn)一步研究該基因功能及蛋白互作等提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為龍眼的成熟葉片，樣品采自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院標(biāo)本園實(shí)驗(yàn)基地的成熟。采摘清洗干凈包裝后，液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｖ饕噭┯校褐参颮NA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，等均購于TaKaRa生物公司;送生物公司進(jìn)行PCR引物的合成與菌液測序;氨芐青霉素（Ampicillin），購自廣州生物工程有限公司;其他的常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器有：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、-80℃超低溫冰箱、-20℃低溫冰箱、PCR儀、移液槍、凝膠電泳儀、凝膠紫外成像儀、超凈工作臺、電泳槽、收集管、紫外檢測儀、培養(yǎng)皿、冷凍高速離心機(jī)、高溫高壓滅菌鍋、恒溫?fù)u床等。

1.2 方法

1.2.1 龍眼葉片總RNA提取和cDNA合成 取約100～150g龍眼成熟葉片樣品加液氮研磨，然后根據(jù)RNA提取試劑盒說明提取龍眼葉片總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度和濃度，cDNA的合成采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 Myb-related-R1基因的獲得 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物KLMyb-related-R1 F、KL Myb-related-R1 R1、KL Myb-related-R1 R2（表1）。試驗(yàn)過程以上述cDNA稀釋2-3倍后的產(chǎn)物為模板，KL Myb-related-R1 F、KL Myb-related-R1 R1為引物，Prime STAR MAX premix（2X）（高保真酶）進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增，再以第1次擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋2～3倍為模板，KL Myb-related-R1 F、KL Myb-related-R1 R2為引物，使用ExTaq酶體系擴(kuò)增第2次。隨后，用膠回收試劑盒回收與目的基因大小條帶相符的基因片段，得到比較純的目的基因，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)回收基因條帶準(zhǔn)確性。

1.2.3 Myb-related-R1基因的克隆與測序 將Myb-related-R1基因回收產(chǎn)物經(jīng)PCR檢測后，將其連接到pMD18-T載體上，稀釋1倍后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，搖床培養(yǎng)，涂板于已添加氨芐抗生素（100mg·L-1）的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)15～18h后隨機(jī)挑選陽性克隆菌，擴(kuò)繁菌液并使用通用引物MF47和MR48進(jìn)行菌落PCR檢測陽性克隆，將檢測條帶大小正確的菌液送生物公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 Myb-related-R1基因ORF的克隆 以龍眼cDNA為模板，用在線設(shè)計(jì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測得到900bp左右的擴(kuò)增片段（圖1a），回收目的片段與PMD18-T載體連接，大腸桿菌菌液培養(yǎng)，再次通過菌液PCR驗(yàn)證后，跑膠并提取目的基因得到900bp左右的基因片段（圖1b）。對陽性克隆菌進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示，該基因ORF全長879bp，編碼292個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2 Myb-related-R1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 Myb-related-R1基因生物信息學(xué)分析 NCBI ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線分析Myb-related-R1的開放閱讀框，用ExPASy ProtParam tool在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析Myb-related-R1的理化性質(zhì)，通過在線軟件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，通過NCBI-BLAST工具與其他物種氨基酸序列進(jìn)行比對分析，利用在線分析工具SignalSignalP 4.1 Server（http：//www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html）在線工具對Myb-related-R1蛋白進(jìn)行信號肽分析，利用在線軟件TMHMM Server.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測Myb-related-R1蛋白的跨膜螺旋區(qū)，用植物亞細(xì)胞定位預(yù)測在線分析工具PSORT II Prediction （https：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用磷酸化位點(diǎn)在線預(yù)測工具NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白的磷酸化位點(diǎn)，利用在線分析工具Prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)，使用Phyre 2 （http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在線工具預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)，利用MEGA5.0采用鄰近相接法（neighbour joining）步長值1000構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用DNAMAN V6軟件進(jìn)行同源基因的多重序列的比對。

2.2.2 Myb-related-R1 編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測及分析 利用在線軟件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測和分析龍眼Myb-related-R1編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的分子式為C1359H2190N406O 438S8，原子總數(shù)為4401，相對分子量為31481.28Da;由292個(gè)氨基酸構(gòu)成。理論等電點(diǎn)pI為6.99，脂肪指數(shù)78.49，總平均親水性預(yù)測為-0.451，屬于親水蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)為68.76，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 Myb-related-R1 蛋白保守序列結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析 通過在線軟件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對Myb-related-R1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，表明該蛋白和SANT-superfamily有類似域架構(gòu)，類似結(jié)構(gòu)部分的超家族序列結(jié)合端粒DNA串聯(lián)重復(fù)序列，對于含有富含G/C基序的重復(fù)序列，結(jié)合依賴于序列[C2-3 A（CA）1-6]。該結(jié)構(gòu)域也存在于調(diào)控轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物中，與DNA結(jié)合;還存在于調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄阻遏物復(fù)合物中，也與DNA結(jié)合。由此可知，該基因其功能區(qū)域可能與端粒結(jié)構(gòu)的功能有關(guān)，亦可能與調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄阻遏物復(fù)合物的功能有關(guān)。

2.2.4 Myb-related-R1蛋白質(zhì)信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位的預(yù)測 使用信號肽在線分析工具SignalSignalP4.1 Server（http：//www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html）對Myb-related-R1蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白為非分泌型蛋白。利用在線軟件TM-HMM-2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測Myb-related-R1蛋白的跨膜螺旋區(qū)，未發(fā)現(xiàn)跨膜螺旋區(qū)，表明該蛋白為非跨膜蛋白。通過在線分析工具PSORT II Prediction （https：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞核，由此可推斷，Myb-related -R1轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核。

2.2.5 Myb-related-R1蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 利用在線預(yù)測工具NetPhos3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析龍眼Myb-related -R1蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示（圖4），該蛋白由35個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)（閾值>0.5）構(gòu)成，其中26個(gè)絲氨酸（Serines）磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)蘇氨酸（Threonine）磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點(diǎn)，由此推測Myb-related-R1蛋白活性的調(diào)控與磷酸化作用有關(guān)系，且在龍眼Myb-related-R1蛋白中發(fā)生磷酸化修飾時(shí)以絲氨酸磷酸化位點(diǎn)為主。

2.2.6 Myb-related-R1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 利用蛋白二級結(jié)構(gòu)在線分析軟件Prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對龍眼Myb-related-R1基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明龍眼Myb-related-R1蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，α-螺旋占18.84%，延長線17.81%，β-折疊占3.08%，無規(guī)則卷曲占60.27%。

通過Phyre 2 （http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在線工具預(yù)測Myb-related-R1蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成（圖5）。

通過蛋白進(jìn)化樹結(jié)果預(yù)測結(jié)構(gòu)最為相似的4個(gè)物種的蛋白三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，荔枝Litchi chinensis MK648002.1蛋白結(jié)構(gòu)與龍眼Myb-related-R1蛋白結(jié)構(gòu)相似度最高，Pistacia vera 阿月渾子XM_031394999.1和Citrus clementina（克萊門氏柑橘）XM_006439654.2蛋白結(jié)構(gòu)相似較高。雖然阿月渾子與Myb-related-R1進(jìn)化樹親緣關(guān)系最近，但三級結(jié)構(gòu)比對中，荔枝與龍眼的相似度最高，故該基因功能極有可能一致。

2.2.7 Myb-related-R1蛋白質(zhì)進(jìn)化樹構(gòu)建和多重序列比對 通過MEGA 4.1軟件Myb-related-R1氨基酸序列與 NCBI中一致性較高的11種植物序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖6），結(jié)果表明，Myb-related-R1與阿月渾子（Pistacia vera XM_.31394999.1）的親緣關(guān)系較近，蛋白結(jié)構(gòu)決定功能，可初步判定該兩者基因功能有相似之處。

使用DNAMAN V6 軟件進(jìn)行同源基因的多重序列的比對（圖7），結(jié)果顯示，該基因含有Myb-related典型保守序列SHAQKYF[9]，確定該序列為Myb-related基因家族中的一員。

3 討論

本研究利用得到的龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫序列信息，篩選并結(jié)合克隆技術(shù)，成功地獲得龍眼Myb-related-R1基因的ORF全長。通過生物信息學(xué)分析軟件發(fā)現(xiàn)，Myb-related-R1屬于MYB基因家族中的Myb-related亞家族，全長879bp，編碼292個(gè)氨基酸，含有1個(gè)Myb-related保守結(jié)構(gòu)域。分析結(jié)果表明，Myb-related-R1基因蛋白屬于親水蛋白，不穩(wěn)定蛋白。通過在線軟件NCBI-CDS對其蛋白保守序列預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與SANT-TRF超家族有聯(lián)系，初步推測其功能與端粒結(jié)合因子有關(guān)，而端粒與染色體的完整性和細(xì)胞分裂周期關(guān)系密不可分。

通過在線軟件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對與Myb-related-R1基因親緣關(guān)系最接近的Pistacia vera XM_.31394999.1阿月渾子蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白結(jié)構(gòu)功能與Myb-related-R1功能預(yù)測結(jié)果相似，均具有端粒重復(fù)結(jié)合因子DNA結(jié)合域，故可預(yù)測該基因有起保護(hù)端粒免受DNA修復(fù)機(jī)制的破壞的作用，但在網(wǎng)絡(luò)上仍未有該基因功能相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

從擬南芥等模型植物研究中發(fā)現(xiàn)，Myb-related轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控基因的表達(dá)參與植物生長發(fā)育全過程、維持植物體內(nèi)初級代謝和次級代謝穩(wěn)定、提高植物體對脅迫的抗逆性[10]且參與植物花青素的合成[11]，發(fā)現(xiàn)Myb-related轉(zhuǎn)錄因子與植物成花之間有著微妙的聯(lián)系。鑒于Myb-related轉(zhuǎn)錄因子對龍眼成花的影響作用尚無相關(guān)報(bào)道，本著探索該基因家族在植物界中龐大的數(shù)量及其在植物體內(nèi)的功能作用的目的，進(jìn)行了龍眼Myb-related轉(zhuǎn)錄因子的克隆，并對其克隆后序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過參考前人對Myb-related基因的研究進(jìn)展，完善了Myb-related基因家族成員信息，進(jìn)而為該基因家族后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

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（責(zé)編：張宏民）