正交法探究幾種因素對啤酒酵母發酵PYF現象的影響

張朝武

摘 要：經查閱大量技術文獻發現，目前國內外報道的影響啤酒酵母發酵PYF現象的主要因素有制麥工藝、微生物代謝產物、酵母菌種特性、麥芽汁的營養成分組成、發酵工藝參數等。本實驗采用的單因素試驗中選取和探究了啤酒麥芽浸麥溫度、浸麥二氧化碳含量、啤酒原料麥芽表面的霉菌數量、麥汁煮沸時鋅離子添加量這4個因素對啤酒酵母發酵PYF現象的影響，正交試驗結果表明：浸麥二氧化碳含量>麥芽霉菌數量>浸麥溫度>硫酸鋅添加量。

關鍵詞：啤酒發酵 ?啤酒酵母 ?酵母PYF ?正交實驗

啤酒酵母發酵PYF（Premature Yeast Flocculation）現象，即啤酒酵母在發酵過程中提前絮凝沉降使啤酒發酵液中的酵母數減少，造成發酵液降糖速度降低、發酵周期延長、啤酒中雙乙酰和乙醛等風味物質含量偏高，進而導致啤酒的發酵過程失敗及可飲性下降。因此，啤酒酵母發酵PYF現象是啤酒釀造過程中一個非常關鍵的技術指標。近年來，國內外諸多啤酒專家和學者研究并報道了啤酒酵母發酵PYF現象的進展和成果，但較為偏重于理論層面的研究，對啤酒工業實際生產的指導意義有限。

目前，已報道的影響啤酒酵母發酵PYF現象的主要因素包括制麥工藝、微生物代謝產物、酵母菌種特性、麥芽汁的營養成分組成、發酵工藝參數等。本實驗設計探究了麥芽表面的霉菌數量、浸麥二氧化碳含量、麥汁煮沸鋅離子添加量、浸麥溫度這4個因素對啤酒酵母發酵PYF現象的影響，同時使用正交實驗探究最佳的因素組合與各個因素的影響大小次序。

1 實驗設備、原材料和方法

1.1 實驗設備

臺秤、EBC標準麥芽粉碎機、啤酒糖化儀、定量快速濾紙、燒瓶、電磁爐、恒溫水浴搖床、250mL的Schott玻璃瓶若干、移液槍、電子顯微鏡、血球細胞計數板、蓋玻片、酵母計數器、蝸旋振蕩器。

1.2 實驗原料

實驗設計要求的試驗啤酒麥芽、城市自來水、斜面酵母菌種、無菌蒸餾水。

1.3 實驗方法

1.3.1 啤酒麥芽的粉碎

按實驗設定的要求將不同的啤酒麥芽用EBC標準啤酒麥芽粉碎機粉碎，取5個糖化杯，每個糖化杯用實驗室臺秤準確稱量100g麥芽粉。

1.3.2 啤酒協定麥汁的制備

設定糖化儀的溫度曲線為：48℃休止40分鐘，63℃休止30分鐘，72℃休止30分鐘，85℃休止5分鐘。將45℃的自來水分別投入5個裝有麥芽粉的糖化杯中，每個糖化杯加入300g水，然后攪拌均勻，放入糖化儀中進行糖化。糖化結束后，用定量快速濾紙過濾糖化的醪液，得到澄清的麥芽汁，之后向麥芽汁中加入少量自來水將麥芽汁的Plato糖度調整為11°。取250mL的Schott玻璃瓶若干，準確稱量Plato糖度為11°的麥芽汁200g分別加入Schott瓶中，擰緊瓶蓋，放入沸水中殺菌60分鐘后取出放入15℃的水浴鍋中保溫備用。

1.3.3 酵母的接種

從冰箱冷藏室中取出試管斜面培養的啤酒酵母，用接種針取一定數量的酵母放入50mL無菌塑料試管中，加入50mL無菌蒸餾水后蓋上試管蓋子，在蝸旋振蕩器上振蕩3分鐘，酵母在無菌蒸餾水中均勻分散后使用5mL移液槍迅速移取5mL酵母水溶液到上述裝有15℃麥芽汁的Schott玻璃瓶中并擰緊瓶蓋。

1.3.4 麥汁的充氧和發酵

將上述Schott玻璃瓶雙臂交叉搖晃振蕩60次，且每20次打開瓶蓋充氧5秒，然后擰緊瓶蓋繼續搖晃振蕩。之后，將充氧和搖勻的發酵液放到15℃恒溫水浴搖床中發酵。

1.3.5 酵母的計數和PYF數值計算

發酵48小時后取出玻璃瓶，打開瓶蓋，用移液槍移取少量發酵液到血球計數板上，蓋上蓋玻片，然后用電子顯微鏡讀出酵母數。此時，將實驗樣酵母數除以標準樣酵母數即為實驗樣的PYF數值。

2 結果與分析

2.1 啤酒酵母發酵PYF現象的單因素實驗

2.1.1 啤酒麥芽表面的霉菌數量對于PYF現象的影響

麥芽表面的霉菌會在特殊的應激環境下分泌霉菌毒素等初級和次級代謝產物，這些代謝產物會影響啤酒酵母發酵PYF現象。實驗室做了5組試驗，得到如下數據：霉菌為3200個/g時，PYF為67%;霉菌為4400個/g時，PYF為70%;霉菌為7100個/g時，PYF為71%;霉菌為25000個/g時，PYF為97%;霉菌為3900個/g時，PYF為92%。通過實驗數據可知，在霉菌菌落數為25000個/g時，得到的PYF數據最大峰值為97%，是較為理想的數據。因此，選擇霉菌數量為20000個/g、25000個/g、30000個/g進行正交實驗設計。

2.1.2 制麥時浸麥溫度對于PYF現象的影響

制麥過程中，當大麥發芽時如外界環境發生變化會使種子產生應激反應，進而生成一些特殊的復雜成分，從而影響后期的酵母發酵過程。使用實驗室微型制麥機，通過調整浸麥溫度得到不同的PYF數據：浸麥溫度為7℃時，PYF為91%;浸麥溫度為10℃時，PYF為100%;浸麥溫度為15℃時，PYF為97%;浸麥溫度為20℃時，PYF為94%;浸麥溫度為25℃時，PYF為83%。由實驗數據可知，在浸麥溫度為10℃時，酵母發酵PYF為最高值100%，故選擇浸麥溫度8℃、10℃、12℃進行正交試驗設計。

2.1.3 制麥時浸麥二氧化碳濃度對于PYF現象的影響

在實驗室微型制麥車間中，通過測定干法浸麥期間開啟或關閉鼓風機檢測了浸麥層的二氧化碳含量，試驗了不同干法浸麥時二氧化碳含量對于酵母發酵PYF現象的影響，試驗數據為：二氧化碳含量為2000ppb時，PYF為103%;二氧化碳含量為5000ppb時，PYF為100%;二氧化碳含量為10000ppb時，PYF為98%;二氧化碳含量為20000ppb時，PYF為95%;二氧化碳含量為25000ppb時，PYF為92%。由試驗數據可知，隨著二氧化碳濃度的升高，PYF值越來越小，因此較低的二氧化碳濃度會減弱PYF現象，故選擇二氧化碳含量為1500ppb、2000ppb、2500ppb進行正交試驗設計。

2.1.4 啤酒麥汁煮沸時鋅離子添加量對于PYF現象的影響

在啤酒糖化麥汁煮沸結束前5分鐘加入酵母營養硫酸鋅——適量添加鋅離子對于酵母的發酵有益，但鋅離子過多會導致酵母發酵機能減弱。本實驗在實驗室協定麥汁中添加硫酸鋅0.25ppm、0.75ppm、1.25ppm、1.75ppm、2ppm，對應的PYF數據為83%、98%、97%、78%、65%。由數據可知，硫酸鋅添加量為0.75ppm時得到的PYF數據比較理想，故選擇硫酸鋅添加量為0.50ppm、0.75ppm、1.00ppm進行正交試驗設計。

2.2 啤酒酵母發酵PYF現象的正交實驗設計

基于單因素的實驗結果進行四因素三水平正交實驗，設計L9（34）正交實驗表，將正交實驗結果的最優發酵組合與得分最高的一組進行最佳條件驗證。

3 結論

根據目前國內外關于啤酒酵母發酵PYF現象的研究表明，其影響因素眾多，但并沒有研究能夠明確表明影響因素的主次順序。本實驗選取4個單因素——浸麥層二氧化碳含量、麥芽表面的霉菌數量、浸麥溫度與硫酸鋅添加量進行探究，雖然它們未必是影響啤酒酵母發酵PYF現象的最主要或關鍵因素，但是通過單因素實驗表明其對PYF的影響顯著，因此可以用這4個因素來進行正交實驗設計。

正交實驗結果表明，對于啤酒酵母發酵PYF現象的影響程度的因素順序為：二氧化碳含量>霉菌數量>浸麥溫度>硫酸鋅添加量。正交實驗得到最優化的結果和組合為：霉菌數量25000個/g、浸麥溫度10℃、二氧化碳含量2000ppb、硫酸鋅添加量0.50ppm，對應PYF值為105%。

本實驗采用的PYF檢測分析方法是根據實際啤酒生產工藝開發的實驗室方法，通過使用相同的實驗設備和安排同一操作人員，可以在很大程度上消除試驗數據的系統誤差，故試驗數據總體可信度較高。

通過本實驗的研究表明，在實際的啤酒生產過程中，控制浸麥時二氧化碳含量和麥芽表面的霉菌數量非常重要，其可以在一定程度上改善啤酒酵母發酵PYF現象。

參考文獻：

[1] （英）布里格斯，李崎，麥芽與制麥技術，中國輕工業出版社，2005年05月.

[2] 李秀婷，現代啤酒生產工藝，中國農業大學出版社，2013年6月1日.

[3] Steve Hindy，啤酒發酵與酯的形成+酒花與啤酒釀造+精釀啤酒釀造技術+酒花酵母麥芽水+啤酒釀造風味指南+菌種用水制麥+啤酒生產工藝配方大全書籍，中信出版集團，2019年8月.