生酮飲食對人肺癌細胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響

張 凡，劉廣超，張之晗，劉方芳，謝 琪，高淑清，*

（1．河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院營養(yǎng)科，河北石家莊 050011；2．中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第980醫(yī)院普通外科，河北 石家莊050011)

正常細胞在有氧條件下通過線粒體氧化磷酸化代謝產(chǎn)能，而腫瘤細胞即使在氧氣充足的條件下仍表現(xiàn)出較高的糖酵解速率，這種從氧化磷酸化到糖酵解的轉(zhuǎn)變稱為“Warburg效應”或“有氧糖酵解”[1]。腫瘤細胞生長、繁殖速度快，而糖酵解產(chǎn)能特點為低效高速，采用糖酵解可以快速代謝更多的葡萄糖，合成大量ATP以滿足其生長需求。Warburg觀察到腫瘤細胞消耗的葡萄糖約為正常細胞的200倍，對于腫瘤細胞來說，它比正常細胞對葡萄糖的缺乏更敏感[2-3]。由于腫瘤細胞的這種特性，我們考慮可以采取降低飲食中碳水化合物的方式，這種飲食方式稱為生酮飲食(ketogenic diets，KD)。KD是由高比例脂肪、極低碳水化合物和適量蛋白質(zhì)組成的一種飲食方案，它可以選擇性切斷腫瘤細胞的能量供應，干預其生存的環(huán)境，從而可以達到抑制腫瘤生長的目的。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞線粒體電子傳輸鏈功能失調(diào)，導致活性氧產(chǎn)生增多。為了維持細胞內(nèi)氧化還原的平衡，腫瘤細胞需要通過啟動抗氧化系統(tǒng)清除過量的活性氧。但是，當細胞內(nèi)活性氧增多超出臨界水平或抗氧化系統(tǒng)受到抑制時，這種氧化還原平衡狀態(tài)就會被打破，造成細胞氧化損傷，導致發(fā)生壞死或凋亡。氧化應激是一種氧化還原失衡狀態(tài)，通過升高活性氧的水平或者抑制細胞抗氧化能力的方法能夠進一步加重氧化應激，可以成為腫瘤治療的一個途徑。4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)是氧化應激的重要標志物，機體氧化應激水平升高時ROS產(chǎn)生增多，導致細胞膜上ω-6多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，最終使4-HNE的表達量增多[4]。有文獻指出生酮飲食抗腫瘤機制可能與AMPK/mTOR信號通路的激活有關，但是生酮飲食是否會通過增強腫瘤細胞的氧化應激抑制腫瘤細胞的生長，目前國內(nèi)還未見相關報道[5-6]。近幾年KD在腫瘤動物模型上取得不錯的效果，但是臨床應用的報道卻很少，所以進一步完善KD抑制腫瘤生長的機制是當前亟須解決的問題。本研究通過建立A549人肺癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，分別給予標準飼料和生酮飼料喂養(yǎng)，觀察KD對裸鼠皮下移植瘤生長的影響，并探討KD抑制腫瘤生長的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗動物

人肺腺癌細胞系A549購自中國科學院干細胞庫。SPF級雌性BALB/c裸鼠購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司，4周齡，體質(zhì)量14～15 g，實驗動物合格證號No.1100111911036198，共10只。所有動物實驗均經(jīng)過河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院動物保護委員會批準，并嚴格按照實驗動物相關規(guī)定進行各項操作。

1.2 主要材料與儀器

DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖溶液、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自北京索萊寶科技有限公司；鼠抗人4-HNE抗體購自美國Abcam公司；標準飼料購自北京市華阜康生物科技股份有限公司，飼料批號1103221900005886；生酮飼料購自深圳捷利康科技有限公司，飼料批號TP201419；血糖儀和血酮儀購自北京怡成電子生物科技股份有限公司。

1.3 動物模型建立與飼養(yǎng)

裸鼠于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)1周后接種細胞。將處于對數(shù)生長期的A549細胞用0.25%胰酶消化，收獲并計數(shù)，調(diào)整濃度為1.0×107/mL，用1 mL注射器將調(diào)整好濃度的細胞懸液注射到裸鼠右下肢皮下，每只接種0.2 mL，共接種10只。接種細胞后，每日觀察裸鼠飲食、精神、大小便、活動及成瘤情況。接種后第8天，肉眼可見接種處有隆起，為橢圓狀。接種后第10天，10只裸鼠均成瘤，隨機分為2組，每組5只，分別為標準飲食組(standard diet，SD)和KD組。分組當天稱量裸鼠體質(zhì)量，游標卡尺測量移植瘤長徑(a)、短徑(b)，按體積公式V=1/2(ab2)計算移植瘤體積，以后每5 d測量1次。SD組裸鼠自由進食標準飼料，KD組裸鼠的飼料量為SD組裸鼠前24 h進食量相等熱量對應的生酮飼料。標準飼料呈顆粒狀，每100 g含蛋白質(zhì)23.8 g，脂肪5.6 g，碳水化合物48.2 g，總熱量為348 kcal。生酮飼料呈黃色糊狀，每100 g飼料含蛋白質(zhì)8.3 g，脂肪66.5 g，碳水化合物8.3 g，總熱量為664.9 kcal。接種后第30天，摘眼球取血處死裸鼠。處死裸鼠后，剝離移植瘤組織，取約一部分瘤體組織迅速放入-80℃冰箱中，用于Western blot檢測，其余瘤體組織放入10%福爾馬林固定液中，用于免疫組化染色。

1.4 血糖、血酮、血脂檢測

接種后第10天，采用北京怡成血糖儀和血酮儀通過尾靜脈采血，分別將血滴于血糖試紙和血酮試紙上，測量相應數(shù)值，以后每5 d測量1次。接種后第30天，摘眼球取血送本院檢驗科進行血脂四項檢測，檢測項目包括總膽固醇(total cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.5 Western blot檢測移植瘤組織中4-HNE蛋白的表達

取-80℃冷凍保存的移植瘤組織，加入適量的RIPA裂解液研磨勻漿，冰上靜置30 min，離心后取上清。BCA法測定蛋白濃度。配置濃縮膠和分離膠。蛋白變性后行10%SDS-PAGE，并將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含脫脂奶粉的封閉液封閉處理1 h，加入一抗(按1∶1 000稀釋)，4℃反應過夜。TBST液洗膜3次，每次10 min；加入二抗(按1∶3 000稀釋)，室溫反應2 h，TBST液洗膜3次，每次15 min，用電化學發(fā)光試劑顯影。采用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，目的蛋白的相對表達水平為目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值。

1.6 免疫組織化學染色檢測移植瘤組織4-HNE蛋白的表達

取10%中性福爾馬林固定的移植瘤組織，常規(guī)脫水，經(jīng)石蠟包埋后切片。將切片按照免疫組化試劑盒說明書進行染色，觀察4-HNE蛋白的表達情況。以腫瘤細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，采用半定量積分法判斷結(jié)果。每張切片隨機選取5個高倍視野(400×)，計算陽性細胞百分率(0～1%記0分，≥1%～10%記1分，≥10%～50%記2分，≥50%～80%記3分，≥80%～100%記4分)；染色強度(無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)。免疫組化評分=陽性細胞百分率評分×染色強度，以免疫組化染色積分反映4-HNE的表達情況。

1.7 統(tǒng)計學方法

所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)用±s表示。符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗。以α=0.05為檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠體質(zhì)量變化

裸鼠體質(zhì)量的測量結(jié)果見圖1。從整個實驗期間的觀察來看，SD組裸鼠體質(zhì)量增長明顯，KD組裸鼠體質(zhì)量增長趨勢較緩。接種后第20天，SD組裸鼠體質(zhì)量為(17.78±0.27)g，KD組為(16.70±0.54)g，兩組裸鼠體質(zhì)量相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 裸鼠的體質(zhì)量變化情況

2.2 裸鼠血糖、血酮及血脂濃度的變化

2.2.1 血糖濃度變化血糖濃度的檢測結(jié)果見圖2。接種后第10天，SD組和KD組裸鼠血糖濃度分別為(8.74±1.34)和(8.50±1.85)mmol/L，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。自接種后第15天起，KD組裸鼠血糖濃度較SD組有所降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。接種后第30天，SD組和KD組裸鼠血糖值分別為(7.16±0.50)和(4.72±0.73)mmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 裸鼠的血糖濃度變化情況

2.2.2 血酮濃度變化血酮濃度的檢測結(jié)果見圖3。接種后第10天，SD組和KD組裸鼠血酮濃度分別為(0.18±0.08)和(0.22±0.08)mmol/L，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。自接種后第15天起，KD組裸鼠血酮濃度均高于SD組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。接種后第30天時，SD組和KD組裸鼠血酮濃度分別為(0.22±0.08)和(1.82±0.31)mmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖3 裸鼠的血酮濃度變化情況

2.2.3 血脂濃度變化血脂濃度的檢測結(jié)果見表1。KD組裸鼠的CHOL、HDL-C、LDL-C濃度高于SD組，而TG濃度低于SD組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 裸鼠的血脂濃度變化情況(mmol/L，±s，n=5)

表1 裸鼠的血脂濃度變化情況(mmol/L，±s，n=5)

與SD組比較，*P＜0.05.

SD KD 1.98±0.42 5.91±0.34*1.64±0.10 0.62±0.25*0.69±0.35 2.45±0.30*0.98±0.41 2.30±0.36*

2.3 裸鼠移植瘤體積變化情況

裸鼠移植瘤體積的測量結(jié)果見圖4。KD組裸鼠移植瘤生長速度較SD組緩慢。接種后第10天、第15天時，兩組裸鼠移植瘤體積差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。接種后第20天，KD組裸鼠移植瘤體積小于SD組，SD 組為(316.17±85.47)mm3，KD組為(209.13±30.51)mm3，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。接種后第30天，SD組裸鼠移植癌體積為(520.68±44.67)mm3，KD組為(388.48±42.27)mm3，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖4 裸鼠移植瘤的生長情況

2.4 Western blot檢測結(jié)果

圖5 Western blot法檢測兩組裸鼠移植瘤組織中4-HNE蛋白的表達

Western blot實驗的結(jié)果見圖5。4-HNE蛋白在SD組和KD組移植瘤組織中相對表達水平分別為1.00±0.03和1.45±0.10，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.5 免疫組織化學檢測結(jié)果

免疫組化實驗結(jié)果見圖6，4-HNE的陽性染色為棕黃色。半定量分析結(jié)果(圖7)顯示，KD組裸鼠移植瘤組織中4-HNE蛋白免疫組化染色積分(4.40±0.89)高于SD組(2.40±0.89)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖6 裸鼠移植瘤組織4-HNE蛋白免疫組織化學染色后觀察

圖7 移植瘤組織中4-HNE蛋白免疫組織化學染色半定量分析

3 討論

1921年Wilder等[7]發(fā)現(xiàn)KD能夠治療難治性癲癇，降低癲癇患者的發(fā)作頻率，被認為是一種安全有效的非藥物治療方式。最近的研究表明KD能夠改變腫瘤細胞新陳代謝，可能會對腫瘤生長產(chǎn)生影響[8-9]。現(xiàn)已有一些國內(nèi)外動物模型研究如惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等均表明，KD具有抑制腫瘤生長作用，但其抗腫瘤機制還不完善。

本研究通過建立人肺癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，分別給予標準飲食和生酮飲食，觀察兩組裸鼠移植瘤的生長情況。結(jié)果顯示，自接種后第20天起，KD組裸鼠移植瘤體積小于SD組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果表明KD可以抑制裸鼠移植瘤的生長，這與國內(nèi)外相關研究結(jié)果一致。Zuccoil等[10]對1例65歲多形性膠質(zhì)母細胞瘤的女性患者，在接受化療和放療的同時，采用生酮飲食2個月，發(fā)現(xiàn)患者血酮體濃度升高，腫瘤消失。Freedland和Masko等[11-12]建立小鼠前列腺癌動物模型，也發(fā)現(xiàn)了KD能夠抑制腫瘤生長。Zhou等[13]建立鼠CT-2A及人U87腦惡性腫瘤動物模型，分別給予未限制總熱量的標準飲食(SD-UR)、未限制總熱量的KD(KD-UR)和限制總熱量的KD(KDR)。結(jié)果顯示與SD-UR和KD-UR組相比，KD-R組腫瘤生長速度顯著降低，而SD-UR組和KD-UR組之間無明顯差異。在本研究中，我們采用的也是限制總熱量的生酮飲食方案，即KD組裸鼠的飼料為SD組裸鼠前24 h進食量相等熱量對應的生酮飼料。雖然限制總熱量的KD使裸鼠移植瘤的生長得到了減緩，但我們的研究還發(fā)現(xiàn)與SD組相比，KD裸鼠自接種后第20天起體質(zhì)量出現(xiàn)了下降。有研究報道在限制總熱量的情況下，裸鼠體質(zhì)量在開始生酮飲食8 d內(nèi)下降20%～30%[13]。Masko等[12]研究表明喂食NCKD及10%和20%碳水化合物的裸鼠需要額外攝入7.5%～10%的熱量才能和標準飲食組的裸鼠保持相似的體質(zhì)量。國內(nèi)學者郝光偉提出不限制總熱量的生酮飲食也具有抑制腫瘤生長的作用[14]。鑒于這種情況，我們考慮在后續(xù)的研究中采用不限制總熱量喂養(yǎng)，觀察其對裸鼠體質(zhì)量以及移植瘤生長的影響。

有學者指出喂養(yǎng)生酮飲食48 h或者更長時間，血酮濃度＞0.3 mmol/L，可被認為達到酮癥狀態(tài)[15]。本研究自喂養(yǎng)生酮飼料第5天起，KD組即達到酮癥狀態(tài)，并持續(xù)至實驗結(jié)束。觀察發(fā)現(xiàn)，KD組裸鼠血酮濃度較SD組明顯升高，這是因為KD為高脂肪、低碳水化合物飲食，給予KD后，大量的脂肪酸分解產(chǎn)生酮體，且腫瘤細胞由于線粒體功能障礙和利用酮體所必需的酶下調(diào)，導致不能有效利用酮體供能，所以出現(xiàn)血酮濃度升高。有研究指出生酮飲食抗腫瘤的機制與血糖及血酮濃度的變化有關，但這一看法還未得到明確肯定[16]。就目前腫瘤動物模型研究來看，KD對血糖濃度的影響是有爭議的。Aggarwal等[17]給接種甲狀腺癌細胞的裸鼠分別喂養(yǎng)SD和KD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)KD組裸鼠的血酮濃度高于SD組，差異有統(tǒng)計學意義，但兩組之間的血糖濃度無顯著差異，這與Otto等[18]研究結(jié)果一致。我們推測這可能是由于所選擇的動物模型和腫瘤類型不同或生酮飼料和標準飼料的脂肪酸組成不同所致。因此，生酮飲食發(fā)揮抗腫瘤作用是否伴隨血糖濃度的下降還需進一步研究。

我們進一步研究這種高脂肪飲食是否會對血脂產(chǎn)生不利影響，在接種后第30天對兩組裸鼠的血脂進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SD組相比，KD組裸鼠的CHOL、LDL-C、HDL-C濃度增加，TG濃度減小，差異均有統(tǒng)計學意義。我們都知道，CHOL和LDL-C濃度的增加對心血管系統(tǒng)的影響是不利的，但HDL-C和TG的變化則是有益的。總體上來說，生酮飲食并未對血脂產(chǎn)生較大的不利影響。

腫瘤細胞因線粒體電子傳輸鏈功能失調(diào)，導致這些電子傳輸鏈生成的活性氧增多。相對于正常細胞，腫瘤細胞被認為存在慢性代謝氧化應激狀態(tài)[19]。如果活性氧的水平不斷增加，那么它們很容易受到因氧化應激誘導的細胞凋亡[20-21]。為了保持氧化還原的平衡，腫瘤細胞通過激活轉(zhuǎn)錄因子NFE2相關因子2增加抗氧化劑的生成，用來限制活性氧的過度積累，避免受到因氧化應激所造成的損傷[22-24]。Albright等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與鄰近的正常細胞相比，乳腺癌細胞中抗氧化劑水平顯著增加。雖然腫瘤細胞自身具有抗氧化能力，但是當通過采用外源性增強機體氧化應激水平的治療方法時，可以促使其死亡。在本研究中我們分別使用Western blot和免疫組化法檢測兩組裸鼠移植癌組織中4-HNE蛋白的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KD組裸鼠移植癌組織中4-HNE蛋白的表達高于SD組。KD通過限制葡萄糖的供應，迫使腫瘤細胞依賴線粒體氧化代謝來產(chǎn)生能量，繼而增強腫瘤細胞氧化應激，促使其死亡。研究表明KD的抗腫瘤機制可能與腫瘤細胞氧化應激的增強有關。

Warburg效應為腫瘤治療提供了新的方向。大量的研究數(shù)據(jù)表明生酮飲食可以延緩腫瘤生長，具有可操作性強、成本低、副作用小等優(yōu)點，既可以單獨使用，也可以與其他抗腫瘤治療方法聯(lián)合使用，可以作為一種易于實施的輔助治療手段用于臨床工作中。近些年KD與放化療聯(lián)合應用于腫瘤動物模型成為一個熱點，且大多都取得不錯的效果，但還需要足夠數(shù)量的臨床研究來支持。本研究將會為生酮飲食或聯(lián)合其他療法治療肺癌提供一定的參考依據(jù)。