能譜CT評(píng)價(jià)貝伐單抗抗大鼠C6膠質(zhì)瘤血管生成效果

韓 蕾，黃曉宇，劉顯旺，鄧亞軍，柯曉艾，周 青，周俊林

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院放射科 蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 甘肅省醫(yī)學(xué)影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見原發(fā)性腫瘤之一，患者中位生存期僅14.6個(gè)月[1]。惡性膠質(zhì)瘤發(fā)病率及死亡率均高，嚴(yán)重危害人類健康與生命安全[2-3]。研究[4-5]表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于新生血管生成，而此過程受血管相關(guān)標(biāo)志物的驅(qū)動(dòng)。抗血管生成藥物是近年來抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，如何在治療過程動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)藥物治療效果是目前臨床面臨的緊要問題，尋找能夠無創(chuàng)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)抗腦膠質(zhì)瘤血管生成藥物療效的方法非常重要。能譜CT已廣泛用于臨床，可采用有效原子序數(shù)、單能量CT值、能譜曲線及物質(zhì)分離技術(shù)量化檢測(cè)病灶的組織結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)。本研究探討能譜CT定量參數(shù)評(píng)估貝伐單抗抗大鼠C6腦膠質(zhì)瘤血管生成療效的可行性及其價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理 30只Sprague Dawley雄性大鼠，SPF級(jí)，12周齡，體質(zhì)量180～230 g,平均(201±16)g，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，許可證編號(hào)：SYXK(甘)2018-0003。C6細(xì)胞株購(gòu)自齊氏生物科技原代細(xì)胞生物制藥,于37、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，隔天換液，通常傳至2～3代。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)以10%胰酶消化3～5 min，之后計(jì)數(shù)、離心，加入不含血清的培養(yǎng)基，以Hanks液沖洗吹打，形成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×106/ml～1×108/ml備用。

1.2 動(dòng)物建模與分組 向大鼠顱內(nèi)注射C6細(xì)胞懸液建立腦膠質(zhì)瘤模型。以2%戊巴比妥麻醉大鼠，頭部固定于腦立體定位儀，暴露顱骨前囟門，以顱骨矢狀縫右側(cè)旁開4 mm、冠狀縫前1 mm處為進(jìn)針點(diǎn)，采用10 μl微量進(jìn)樣器抽取C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液10 μl，以1 μl/min速度注入，注射完畢針頭停留5 min后垂直拔針，以骨蠟封閉針后縫合、消毒術(shù)區(qū)。造模2周后(用藥前)行能譜CT觀察成瘤情況，并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每日分別腹腔注射貝伐單抗注射液5 mg/kg體質(zhì)量及同等劑量濃度0.9%生理鹽水，連續(xù)注射1周。

1.3 儀器與方法 采用GE Discovery HD 750能譜CT儀，分別于用藥前及用藥4、8天對(duì)所有大鼠行顱腦CT掃描。麻醉大鼠后保定于CT掃描床進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)：軸掃模式，探測(cè)器寬度20 mm，掃描視野Small Head，顯示視野9 cm，球管轉(zhuǎn)速0.5 r/s，管電壓80/140 kV瞬時(shí)切換，層厚0.625 mm；以流率0.2 ml/s注入對(duì)比劑碘海醇(300 mgI/ml) 2.5 ml/kg體質(zhì)量后行增強(qiáng)掃描，延遲時(shí)間30 s。采用標(biāo)準(zhǔn)模式重建算法、30%自適應(yīng)統(tǒng)計(jì)迭代重建算法對(duì)圖像進(jìn)行重建。由2名具有15年神經(jīng)影像學(xué)診斷經(jīng)驗(yàn)的主任醫(yī)師獨(dú)立分析圖像，于3個(gè)不同層面瘤體實(shí)質(zhì)區(qū)盡量避開腫瘤囊變壞死區(qū)域勾畫3個(gè)直徑為0.5 mm的圓形ROI，測(cè)量能譜CT定量參數(shù)[40～140 keV單能量CT值、碘(水)含量]，取其均值為最后結(jié)果。記錄2組腫瘤體積。

1.4 病理學(xué)檢查 每次能譜CT掃描結(jié)束后分別于2組隨機(jī)各選3只大鼠，行心臟灌流后處死，取全腦組織，經(jīng)常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋等處理后行HE染色及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)染色。由2名具有15年工作經(jīng)驗(yàn)的病理科主任醫(yī)師遵循盲法原則獨(dú)立分析，并檢測(cè)陽性細(xì)胞(細(xì)胞核深染為深棕色)數(shù)量，以2者測(cè)量結(jié)果的均值為最后結(jié)果。每次染色均設(shè)立陰性和陽性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以百分比表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組能譜CT定量參數(shù)的差異。以Kappa檢驗(yàn)分析2名病理科醫(yī)師檢測(cè)VEGF結(jié)果的一致性，Kappa≤0.20為一致性較差，0.20

2 結(jié)果

2.1 大鼠C6膠質(zhì)瘤模型能譜CT影像學(xué)表現(xiàn) 30只大鼠中，2只未見成瘤，2只完成用藥前掃描后意外死亡，最終實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各13只大鼠納入研究。實(shí)驗(yàn)組用藥前、用藥4、8天腫瘤體積分別約(84.28±13.52)、(80.80±12.12)及(77.25±4.12)mm3；對(duì)照組分別約(83.33±14.65)、(99.82±13.15)、(113.25±20.52)mm3；不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組增強(qiáng)后瘤體實(shí)性成分均明顯強(qiáng)化，中心壞死區(qū)無強(qiáng)化；對(duì)照組增強(qiáng)后瘤體邊緣明顯強(qiáng)化，中心壞死區(qū)強(qiáng)化程度減低，見圖1。

圖1 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦膠質(zhì)瘤能譜CT圖像 A.實(shí)驗(yàn)組用藥前； B.實(shí)驗(yàn)組用藥4天； C.實(shí)驗(yàn)組用藥8天； D.對(duì)照組用藥前； E.對(duì)照組用藥4天； F.對(duì)照組用藥8天

2.2 能譜CT各定量參數(shù) 2組用藥前70 keV單能量CT值及碘濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)組用藥4、8天70 keV單能量CT值及碘濃度均低于對(duì)照組(P均<0.05)，見表1。

表1 2組不同時(shí)間點(diǎn)能譜CT各定量參數(shù)值比較(±s)

表1 2組不同時(shí)間點(diǎn)能譜CT各定量參數(shù)值比較(±s)

組別用藥前n70 keV單能量CT值(HU)碘濃度(mg/cm3)用藥4天n70 keV單能量CT值(HU)碘濃度(mg/cm3)用藥8天n70 keV單能量CT值(HU)碘濃度(mg/cm3)實(shí)驗(yàn)組1385.97±9.0417.48±2.071080.58±5.5711.91±3.23775.51±5.429.51±1.36對(duì)照組1381.35±9.9818.21±1.431090.77±9.6722.32±5.35792.08±7.4227.12±5.06t值-1.35-0.99--3.56-6.42--6.43-13.01P值-0.180.33-<0.05<0.05-<0.05<0.05

2.3 病理學(xué)檢查 2名醫(yī)師檢測(cè)VEGF結(jié)果的一致性較強(qiáng)(Kappa=0.61，P<0.05)。用藥前2組光鏡下均見腫瘤實(shí)性區(qū)瘤細(xì)胞排列密集，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大，深染，核漿比例增大；隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組瘤內(nèi)逐漸出現(xiàn)小點(diǎn)狀或小斑片狀壞死區(qū)域，腫瘤細(xì)胞排列相對(duì)松散，細(xì)胞結(jié)構(gòu)塌陷，壞死區(qū)周圍可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組腫瘤組織壞死區(qū)域相對(duì)較少。VEGF檢測(cè)結(jié)果：用藥前實(shí)驗(yàn)組(45.40%)和對(duì)照組(46.50%)陽性細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11)，用藥4、8天實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞百分比(33.93%、25.00%)均低于對(duì)照組(53.28%、63.80%，P均<0.05)，見圖2。

圖2 2組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織VEGF免疫組織化學(xué)染色(×200) A.實(shí)驗(yàn)組用藥前； B.實(shí)驗(yàn)組用藥4天； C.實(shí)驗(yàn)組用藥8天； D.對(duì)照組用藥前； E.對(duì)照組用藥4天； F.對(duì)照組用藥8天

2.4 能譜CT各定量參數(shù)與免疫組織化學(xué)結(jié)果的相關(guān)性 隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組70 keV單能量CT值、碘濃度逐漸降低，對(duì)照組70 keV單能量CT值、碘濃度逐漸增高；2組不同時(shí)間點(diǎn)70 keV單能量CT值、碘濃度值均與VEGF呈正相關(guān),見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)能譜CT各定量參數(shù)與VEGF結(jié)果的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

新生血管形成是膠質(zhì)瘤的特征性表現(xiàn)之一。腫瘤細(xì)胞分裂、增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均依賴于新生血管[6]，后者與患者預(yù)后密切相關(guān)[7]。新生血管生成是藥物治療的重要靶點(diǎn)，目前已成為研究熱點(diǎn)。VEGF是一種重要的血管生成影響因子，在膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)[8-9]，其表達(dá)量越高，腫瘤惡性程度越高。研究[10-11]表明施加抗血管生成藥物靶向治療一定時(shí)間后腫瘤組織新生血管減少，改善組織氧化作用，相應(yīng)亦會(huì)改善腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)放射治療及化學(xué)治療療效；而如何在藥物治療過程中動(dòng)態(tài)觀察藥療效則是臨床中亟待解決的問題。

能譜CT通過有效原子序數(shù)、單能量CT值、能譜曲線及物質(zhì)分離技術(shù)量化檢測(cè)病灶的組織結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)，提高病灶對(duì)比度及檢出率[12]。研究[13]表明能譜CT定量參數(shù)可評(píng)估大鼠C6膠質(zhì)瘤新生血管形成。TANG等[14]比較62例腹部傳統(tǒng)CT與能譜CT圖像，發(fā)現(xiàn)單能量CT為50～70 keV時(shí)圖像對(duì)比信噪比最佳，顯示胃結(jié)腸韌帶最清晰。本研究基于26只SD大鼠能譜CT圖像繪制最佳對(duì)比噪聲比曲線，均在70 keV單能量圖像獲得較好的對(duì)比噪聲比，故將70 keV單能量成像確定為顯示腫瘤與瘤周組織的最佳單能量圖像。

貝伐單克隆抗體是重組人源性VEGF單克隆IgG1抗體[15]，通過與VEGF-A結(jié)合而競(jìng)爭(zhēng)性抑制其與細(xì)胞表面相應(yīng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)的結(jié)合，進(jìn)而抑制腫瘤血管生成。本研究中實(shí)驗(yàn)組經(jīng)抗血管生成藥物貝伐單抗治療后70 keV單能量CT值、碘濃度均下降；用藥4、8天實(shí)驗(yàn)組70 keV單能量CT值、碘濃度均低于對(duì)照組，VEGF陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少；分析原因，中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤VEGF-A過量表達(dá)，腫瘤內(nèi)部存在大量新生血管，而新生血管越多，微血管密度越高，腫瘤強(qiáng)化程度越強(qiáng)，病灶內(nèi)碘含量就越多，相應(yīng)單能量CT值及碘濃度就越高，貝伐單抗藥物競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGF與細(xì)胞表面VEGFR相結(jié)合，導(dǎo)致VEGF表達(dá)量降低，新生血管生成受到抑制，相應(yīng)單能量CT值及碘濃度降低。

綜上所述，能譜CT定量參數(shù)70 keV單能量CT值及碘濃度可無創(chuàng)、動(dòng)態(tài)評(píng)估貝伐單抗抗大鼠C6腦膠質(zhì)瘤血管生成療效，有望成為評(píng)價(jià)抗腫瘤血管生成藥物療效的新方法。本研究的主要局限性：①樣本量少；②CT軟組織分辨率較低，難以清晰顯示腫瘤內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致ROI中包含微囊變區(qū)域；③腫瘤體積較小，勾畫ROI難免受到容積效應(yīng)的影響。