高粱單寧含量對清香型大曲白酒酒醅中細菌種群的影響

楊 玲 ，王 琪 ，郭旭凱，段 冰，郭 睿，邵 強，柳青山

（1.山西省農業科學院高粱研究所，山西晉中 030600；2.山西大學生命科學學院，山西太原 030006）

清香型大曲白酒是我國的四大白酒之一，它以高粱為主要原料釀造而成。在釀造過程中，高粱品種的質量直接影響著白酒的產量和品質。高粱的理化品質不僅包括淀粉、脂肪、蛋白質等，同時還包括其他重要的物質如單寧。單寧又稱多酚，是植物的次生代謝產物。單寧根據其化學性質分為水解單寧和縮合單寧。水解單寧的相對分子質量為500～3 000 Da，主要分布在茶、水果、豆類和堅果中；縮合單寧的相對分子質量為2 900～28 000 Da，通常存在于谷物、菜籽、雙子葉植物等體內。縮合單寧是高粱中單寧的主要存在形式。已有研究表明，不同品種高粱中的單寧含量不同，若單寧含量過高，則會阻礙白酒發酵的正常進行，使成品酒香氣不足、口感苦澀[1]；相反若單寧含量過低，則會導致成品酒因缺少主要成味物質而口感寡淡[2]。而適量的單寧除了可賦予白酒特殊的香氣和提升口感[3-5]之外，更重要的是部分微生物能分泌單寧酶而降解單寧[6-7]；因此，高粱單寧能通過影響白酒釀造過程中微生物的生長來間接影響出酒率[1-2，8-9]。而目前國內外的相關研究尚非常少，蔣蘭等[1，10]研究發現，適量單寧能抑制白酒發酵中部分有害微生物的生長。

適中的單寧含量是優質高粱的必備條件[11]。本研究利用高通量測序技術比較了含單寧高粱和不含單寧高粱對清香型大曲白酒酒醅中細菌種群的影響，并分析了高粱單寧含量與細菌種群的關系，旨在為選育具有合理單寧含量的高粱品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

采自山西省汾陽市某清香型大曲白酒廠的酒醅，其釀造原料分別是同種高粱的含單寧品種和不含單寧品種。

1.1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠回收試劑盒：日本寶生物工程株式會社；2×Phusion High-Fidelity PCR Master Mix：美國紐英倫生物技術公司；Ion Plus建庫試劑盒：美國賽默飛世爾公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ALS 1296聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc 2000 UV凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；5417R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；HH數顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；SIM-F123制冰機：日本三洋電子有限公司；SK-1國華快速混勻器：常州國華電器有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；Nova-Seq6000測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造階段操作條件

釀造過程共21 d，分別經歷以下3個階段：①升溫階段（1～7 d）：起始溫度約15 ℃，每天升溫2 ℃，約第7天達到28 ℃；②穩定階段（8～15 d）：在28 ℃維持8 d；③降溫階段（16～21 d），每兩天降溫1 ℃，約6 d后降至25 ℃。在升溫階段的初期（第1天）、中期（第3天）、末期（第7天）和降溫階段的末期（第21天）分別取樣，含單寧的樣品編號為A、B、C和D，而不含單寧的樣品編號為a、b、c和d。每個樣品3個平行。

1.3.2 樣品基本理化指標測定

溫度的測定：在發酵缸內距離表層30 cm處的中心點測定。含水量的測定：依據GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》進行。單寧含量的測定：依據GB/T 15686—2008《高粱單寧含量的測定》進行。

1.3.3 樣品細菌基因組DNA的提取及檢測

用磷酸緩沖液（0.1 mol/L）洗滌樣品3次，收集菌體。利用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取細菌的基因組DNA[12]，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 樣品16SrDNAV4區的PCR擴增及測序

擴增引物515F：5'-TGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTTCTAAT-3'。PCR反應體系（30μL）：2×Mix，15μL；515F（2μmol/L），3μL；806R（2μmol/L）3 μL；基因組DNA，10μL（5～10ng）；ddH2O補至30μL。PCR反應條件：預變性94℃、5 min；變性94 ℃、30 s；退火55℃、30 s；延伸72℃、90 s；35個循環后，72 ℃保溫10 min。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將擴增產物使用建庫試劑盒構建文庫，經Thermofisher的IonS5XL上機測序。由北京諾禾致源生物公司完成。

1.3.5 生物信息分析

將測序得到的原始序列進行質控、過濾、去嵌合體，得到有效序列。將有效序列按97%的相似度進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，即分子水平分類的“種”[13]。選取每一個OTU中的代表序列進行物種注釋。

1.3.6 多樣性分析和統計分析

對OTU進行豐度分析，計算樣品的多樣性指數。利用Edge R軟件進行統計分析以比較差異性。

2 結果與分析

2.1 高粱樣品基本理化指標的測定

表1 高粱樣品基本理化指標的測定Table 1 Determination of normal physicochemical index of sorghum samples

由表1可知，在發酵旺盛階段，含單寧樣品溫度略低于不含單寧樣品的溫度；在整個發酵階段，不含單寧樣品的含水量較高，這表明不含單寧高粱樣品更有利于產生水分的微生物的生長。兩種樣品的單寧含量在整個發酵過程中不斷下降，這表明單寧參與了整個發酵過程，對樣品的理化特性有一定的影響。

2.2 不同單寧含量高粱樣品中細菌多樣性的豐度

表2 不同高粱樣品的原始序列數、有效序列數和OTU數Table 2 Original sequence number,effective sequence number and OTU number of different sorghum samples

由表2可知，在發酵第1、3、7和21天，含單寧樣品中的OTU分別是1 115、506、1 129和445個；不含單寧樣品中的OTU分別是2 086、689、806和682個。在發酵初期，不含單寧樣品的OTU數量多于含單寧樣品的；但是在發酵中期情況相反，這可能是由于發酵中期單寧含量降低，對細菌的抑制作用降低，從而增加了細菌的數量。

稀釋曲線可直接反映測序數據量的合理性，當曲線趨向平坦時，說明測序深度基本可以覆蓋樣品中的所有物種。豐度等級聚類曲線可直觀地反映樣本中物種的豐富度和均勻度，在橫軸方向上，曲線的跨度越大，表示物種的豐富度越高；在縱軸方向上，曲線越平緩，表示物種分布越均勻[14]。

圖1 不同高粱樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of different sorghum samples

圖2 不同高粱樣品的豐度等級聚類曲線Fig.2 Rank-abundance curves of different sorghum samples

由圖1可知，8個樣品的稀釋曲線均趨于平緩，表明測序量可以較好地反映酒醅中的物種信息。由圖2可知，在發酵的初期和末期，不含單寧的樣品比含單寧的樣品的細菌種類豐富、均勻。

2.3 不同單寧含量高粱樣品中細菌的多樣性分析

2.3.1α-多樣性分析

香儂指數可以反映樣品的物種多樣性，香儂指數越大，說明樣品內物種豐度越多[15]。Chao1指數即物種豐富度指數，可以預測樣品中細菌的總種類數[16]。不同樣品OTU的α-多樣性分析結果見表3。

由表3可知，在發酵的第1天和第3天，不含單寧樣品的香儂指數高于含單寧樣品的；但在第7和第21天，情況卻完全相反。說明在發酵中后期，樣品中的單寧含量影響了細菌種群的豐度。由Chao1指數預測值OTU數（表3）與實際OTU數（表2）相比結果可知，OTU的預測值與實際值有80%～90%的符合度，說明測序結果基本可以代表樣品的種類數。

表3 不同高粱樣品的OTU的α-多樣性指數Table 3 α-diversity indexes of OUT of different sorghum samples

2.3.2β-多樣性分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種對多維數據進行降維后提取出最主要元素的方法。不同樣品OTU的PCA分析結果見圖3。由圖3可知，主成分1和主成分2的樣品中細菌種群的差異性貢獻率分別為40.50%和9.99%。對于含單寧和不含單寧的樣品來說，除了發酵第1天外，其余每個發酵時間的細菌均能較好地聚集在一起，說明除了發酵第1天外，每個樣品的3個平行之間的細菌種群相似。在整個發酵過程中，含單寧的樣品和不含單寧的樣品之間均有間隔，說明二者的細菌種群有差異。

圖3 不同高粱樣品的細菌種群主成分分析Fig.3 PCA analysis of bacteria community of different sorghum samples

2.4 細菌種群結構分析

2.4.1 不同單寧含量高粱樣品細菌種群在門水平上的組成

劉劍文解釋道，在個人所得中，有勞動所得（積極所得），也有非勞動所得（消極所得）。前者比如工薪所得、勞務所得、稿酬所得和特許權使用費所得，而后者比如利息、股息、紅利所得、偶然所得等，而按照目前的稅制，只需繳納20%的稅。

由圖4可知，含單寧樣品和不含單寧樣品中的細菌類群排名前10的是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）和螺旋體門（Spirochaetes）。

在整個發酵過程中，含單寧樣品和不含單寧樣品中的細菌類群差異很大。在發酵第1天，含單寧樣品和不含單寧樣品中的優勢類群分別為厚壁菌門和其他類群。在發酵第3天，含單寧樣品和不含單寧樣品中的優勢類群分別為變形菌門和厚壁菌門，可見樣品的單寧含量在發酵初期對樣品細菌類群的影響很大。造成這一差別的原因可能是樣品中一定濃度的單寧可以被微生物分泌的單寧酶分解[3]，而過高濃度的單寧則會抑制微生物的生長[1，10]。而白酒發酵是多種微生物混合發酵的過程，因此，部分微生物的生長情況會直接影響群體的結構，從而導致了細菌類群的差異。在發酵第7天和第21天，含單寧樣品和不含單寧樣品中的優勢類群均為厚壁菌門。

圖4 不同高粱樣品的細菌種群在門水平上的分布Fig.4 Distribution of bacterial community of different sorghum samples at phylum level

王青山[17]對不同地域清香型白酒發酵微生物種群結構的比較結果中，厚壁菌門和變形菌門是主要種群，且發酵中期后，厚壁菌門占主要地位，這與其他香型白酒微生物的研究結果相吻合[18-21]。李曉然[22]發現汾酒發酵過程中的主要細菌也是厚壁菌門。這與該研究結果是一致的。

2.4.2 不同單寧含量高粱樣品細菌種群在屬水平上的組成

圖5 不同樣品的細菌種群在屬水平上的分布Fig.5 Distribution of bacterial community of different samples at genus level

由圖5可知，含單寧樣品和不含單寧樣品中的細菌類群主要為片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）和窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）等。

在整個發酵過程中，含單寧樣品和不含單寧樣品中的細菌類群在屬水平上差異很大。在發酵第1天，含單寧樣品和不含單寧樣品中的第一優勢類群均為其他屬。在發酵第3天，含單寧樣品中的絕對優勢類群依然是其他屬，而不含單寧樣品中的優勢類群則為魏斯氏菌屬。在發酵第7天，含單寧樣品中的優勢類群還是其他屬，只是比例大幅度降低，不含單寧樣品中的優勢類群變成了片球菌屬。在發酵第21天，含單寧樣品和不含單寧樣品中的優勢類群均為片球菌屬，比例均高于第7天樣品的。

綜上，本實驗中清香型大曲白酒酒醅的優勢類群為片球菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，這與其他研究者的結果部分相符[17]。乳桿菌屬、魏斯氏菌屬存在于多種香型白酒的發酵過程中，也是白酒發酵中主要的功能種群[17-19，21，22]，為白酒中風味物質的合成提供前體物質[18，23]。

2.5 不同單寧含量高粱樣品的細菌種群在屬水平上的區別

圖6 含單寧和不含單寧的高粱樣品在屬水平上的細菌種群比較Fig.6 Comparison of bacteria community of sorghum samples with and without tannin at genus level

由圖6可知，在發酵第1天，在對兩種樣品物種差異貢獻度排名前10的物種中，乳桿菌屬在含單寧樣品中的豐度大于不含單寧樣品中的豐度；其次是魏氏菌屬（見圖6A）；但是它們的豐度差異在統計學上不顯著。在發酵第3天，魏氏菌屬在含單寧樣品中的豐度遠低于不含單寧樣品中的豐度；其次是片球菌屬；乳桿菌屬在含單寧樣品中的豐度略低于不含單寧樣品中的豐度（見圖6B）。在發酵第7天，片球菌屬在含單寧樣品中的豐度低于不含單寧樣品中的豐度；魏氏菌屬和乳桿菌屬在二者中的豐度差別不大（見圖6C）。在發酵第21天，片球菌屬在含單寧樣品中的豐度低于不含單寧樣品中的豐度；相反，乳桿菌屬在含單寧樣品中的豐度高于不含單寧樣品中的豐度；魏氏菌屬在含單寧樣品中的豐度低于不含單寧樣品中的豐度（見圖6D）。總之，單寧含量對乳桿菌屬在整個發酵過程中豐度的影響較大，而對于魏氏菌屬和片球菌屬在整個發酵過程中豐度的影響則較小。

2.6 發酵時間和單寧含量與樣品中細菌種群分布的關聯性

2.6.1 VPA分析

方差劃分標準對應分析（variance partitioning canonical correspondence analysis，VPA）[24]用于表示造成微生物群落分布差異的各環境因子的貢獻度大小，本研究中導致樣品細菌種群的差異的環境因子見圖7。由圖7可知，發酵時間和單寧含量對樣品中細菌種群分布差異的貢獻度分別為31.87%和22.39%；二者共同對細菌種群分布差異的貢獻度為10.58%。

圖7 環境因子對群落差異貢獻率的方差劃分標準對應分析Fig.7 Variance partitioning canonical correspondence analysis of contribution rates of environmental factors to community differences

2.6.2 Spearman相關性分析

Spearman相關性分析可以研究環境因子與物種之間的相關性[25]。本研究中環境因子發酵時間與樣品中物種之間的相關性見圖8和9，單寧含量與樣品中物種之間的相關性見圖8和10。

由圖8和圖9可知，有5個屬與發酵時間顯著相關（P＜0.05），分別是片球菌屬、藍細菌綱的未知屬、擬桿菌屬、立克次氏體目的未知屬、Roseovarius；其中片球菌屬與發酵時間呈正相關，立克次氏體目的未知屬與發酵時間呈極顯著相關（P＜0.05）。由圖8和圖10可知，有3個屬與單寧含量呈顯著負相關（P＜0.05），分別是芽孢桿菌屬、腸球菌屬、類芽孢桿菌屬，其中類芽孢桿菌屬與單寧含量呈極顯著負相關（P＜0.01）。

圖8 發酵時間和單寧含量與細菌屬水平種群相關性分析Fig.8 Analysis of correlation of fermentation time and tannin content and bacteria community at genus level

圖9 發酵時間與細菌屬水平種群相關性分析Fig.9 Analysis of correlation of fermentation time and bacteria community at genus level

圖10 單寧含量與細菌屬水平種群相關性分析Fig.10 Analysis of correlation of tannins content and bacteria community at genus level

郭旭凱等[26]利用純培養方法研究了山西老陳醋酒化階段高粱單寧對乳酸菌和醋酸菌生長的影響，結果發現，當高粱單寧含量為0～1.5%時，所有乳酸菌和醋酸菌的生長均被促進；當單寧含量為2.0%時，對不同菌的生長影響不同；而當單寧含量為3.0～6.0%時，所有乳酸菌和醋酸菌的生長均被抑制，且單寧濃度越高抑制作用越強；直到濃度為6.0%時菌株徹底不生長。對于清香型大曲白酒，高粱單寧含量在1.0%左右時，不會影響出酒率；但超過1.4%時，有可能會降低出酒率，但卻可能提高白酒的品質[2]。綜上可知，高粱中的單寧含量與細菌的種群有一定的關系，具體機理還需要深入研究。

3 結論

本實驗利用高通量測序技術對清香型大曲白酒含單寧高粱和不含單寧高粱酒醅中的細菌種群進行了分析，研究了高粱單寧含量對細菌種群的影響。多樣性分析結果顯示，在發酵的第1天和第3天，不含單寧酒醅的細菌種群多樣性高于含單寧酒醅的；但在發酵第7天和第21天的酒醅中卻完全相反。兩種酒醅中的細菌類群有：片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）等。單寧含量對細菌種群差異的貢獻率為22.39%，芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）與單寧含量呈顯著負相關（P＜0.05）。

單寧廣泛存在于高粱中，而高粱是是清香型大曲白酒釀造的主要原料。因此，單寧含量的高低直接影響整個釀造過程中的細菌種群，從而進一步影響到發酵的走向，并最終影響白酒的品質。因此，本研究對選育具有合理含量單寧的高粱、促進清香型大曲白酒釀造工業的發展具有重要的指導意義。