響應面法優化苦蕎麥鹽溶性球蛋白提取工藝研究

吳 穎，王 嘯，邱樹毅，馬琳娜，郭佳佳

（貴州大學釀酒與食品工程學院貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025）

蕎麥有甜蕎麥、金蕎麥和苦蕎麥三種[1]。苦蕎麥（Fagopyrum tatarium）為廖科蕎麥屬、雙子葉、一年生草本植物[2]，是一種藥食同源植物。其豐富的蛋白質（8.51%～18.87%）[3]含量高于甜蕎、小麥、水稻、高粱等[2]，且氨基酸種類多。苦蕎蛋白根據溶解性不同可分為水溶清蛋白、鹽溶球蛋白、醇溶蛋白、堿溶或者酸溶的谷蛋白[4]。苦蕎蛋白具有調節血脂代謝[5-6]、抗氧化[7]、抑菌[8-9]、調節腸道菌群[4-5，10]等多種生物活性。目前，提取植物種子蛋白的方法主要有堿溶酸沉法、乙醇提取法、膜分離法、超聲提取法、酶解酸沉法、離子交換法和Osborne法[11]。使用較多的是堿溶酸沉法，但加工過程中強堿易使蛋白理化性質改變，并且在提取過程中會消耗大量的酸堿等缺點[3]。有研究表明，蕎麥蛋白降血壓降膽固醇功能優于大豆蛋白[12]，李紅梅等[13]通過研究苦蕎麥四種蛋白成分體外抗氧化活性，清蛋白球蛋白均有體外抗氧化活性，其中球蛋白抗氧化活性最強。苦蕎麥不同蛋白組分活性作用不同，苦蕎球蛋白有較好的抗氧化性、抗疲勞[14]、降血脂[7]等活性作用。現階段大部分都是對苦蕎麥球蛋白的功能性質和生物活性進行研究，但是對球蛋白的提取工藝研究較少。苦蕎麥球蛋白含有可應用于食品和醫藥的活性成分，在研究球蛋白活性作用和加工特性前，高效制備球蛋白具有重要意義。Osborne分級法提取蛋白操作簡單、成本低。該研究以貴州威寧苦蕎麥為研究對象，采用Osborne分級法提取苦蕎麥球蛋白，利用響應面法優化苦蕎麥球蛋白的提取工藝條件，高效制備球蛋白，為后面開展球蛋白活性研究打好基礎，為苦蕎麥球蛋白的綜合開發利用提供材料來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎麥：采摘于貴州省威寧縣；體積分數85%的磷酸、氯化鈉（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；體積分數95%的乙醇、石油醚（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

Thermo CR3i冷凍型多功能離心機：美國賽默飛世爾科技公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海邦西儀器科技有限公司；SpectraMaxR190酶標儀：美谷分子儀器有限公司；FA2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；XTP-200G高速多功能粉碎機：浙江永康市紅太陽機電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將干燥的苦蕎麥種子于多功能粉碎機中粉碎，過80目篩。在苦蕎麥粉中以1∶5（g∶mL）的比例加入石油醚進行攪拌脫脂處理，脫脂期間數次更換石油醚[11，15-16]。將脫脂后的苦蕎麥粉過濾收集，于通風櫥中風干備用。

1.3.2 Osborne分級法提取苦蕎麥球蛋白

稱取5.00 g處理過的苦蕎麥粉，在前期的研究基礎上，采用最優工藝條件提取苦蕎麥清蛋白。將提取清蛋白后的沉淀用氯化鈉溶液在一定的鹽含量、料液比、浸提溫度、浸提時間的條件下進行攪拌浸提，再次以相同條件離心，上清液為球蛋白溶液，取上清液測定球蛋白含量。

1.3.3 測定方法

苦蕎麥粗蛋白質含量：按照參考文獻[17]的方法進行測定。

蛋白含量測定：采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量[1]，以吸光度值A為縱坐標（y），蛋白質量濃度（mg/L）為橫坐標（x），繪制蛋白質標準曲線，建立回歸方程：y=0.003 9x+0.006 2（R2=0.997 3）。

蛋白提取率計算公式[18]如下：

1.3.4 苦蕎麥球蛋白提取單因素試驗

提取完清蛋白的沉淀用氯化鈉溶液攪拌浸提球蛋白，分別考察鹽含量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、浸提溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、浸提時間（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min）對球蛋白提取率的影響。

1.3.5 苦蕎麥球蛋白提取工藝優化響應面試驗

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

在單因素試驗的基礎上，應用響應面優化法中的Box-Behnken Design（BBD）試驗設計法進行設計。以鹽含量（A）、料液比（B）、浸提溫度（C）和浸提時間（D）為考察因素，以球蛋白提取率（R）為響應值，進行4因素3水平的響應面分析試驗，優化提取球蛋白的最佳工藝參數。每個試驗組合重復測定2次，取其平均值作為結果，其因素與水平編碼表見表1。

2 結果與分析

2.1 鹽含量對苦蕎麥球蛋白提取率的影響

圖1 鹽含量對苦蕎麥球蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of salt content on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由圖2可知，在一定鹽含量范圍內，隨著鹽含量的增加，蛋白提取率逐漸增加。當鹽含量為1.0%時球蛋白提取率達到最大值3.81%，鹽含量為1.2%時球蛋白提取率有所下降。可能是鹽含量過大，鹽與水分子作用加強，造成球蛋白溶解度降低[18]，或是蛋白質亞基之間相互作用造成影響，破壞了蛋白的穩定性，蛋白提取率下降[19]。因此，選擇鹽含量1.0%進行后續試驗。

2.2 料液比對苦蕎麥球蛋白提取率的影響

圖2 料液比對苦蕎麥球蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由圖2可知，料液比增加，促進了球蛋白在鹽溶液中的溶解，料液比為1∶15（g∶mL）時蛋白提取率達到最大值5.37%。隨著料液比的繼續增加，蛋白提取率開始下降，可能是體系中鹽離子增加導致蛋白質變性，從而使球蛋白溶解度降低，提取率下降[20]。因此，選擇料液比為1∶15（g∶mL）進行后續試驗。

2.3 浸提溫度對苦蕎麥球蛋白提取率的影響

圖3 浸提溫度對苦蕎麥球蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由圖3可知，隨著浸提溫度的升高，蛋白提取率增大。在30～40 ℃之間蛋白提取率顯著增加。可能是溫度升高有助于蛋白質分子熱運動，從而有更多蛋白質溶于水。在50～55 ℃之間蛋白提取率增加緩慢，浸提溫度為55 ℃時，蛋白提取率達到最大值5.43%。蛋白質的糊化和變性溫度是在60～80 ℃之間，浸提溫度是50 ℃和55 ℃時蛋白提取率變化不大，但是溫度過高，對蛋白穩定性有影響，且提取成本增加。因此，選擇浸提溫度55 ℃進行后續試驗。

2.4 浸提時間對苦蕎麥球蛋白提取率的影響

圖4 浸提時間對苦蕎麥球蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由圖4可知，隨著浸提時間增加，蛋白提取率增大，浸提時間是90 min時蛋白提取率達到最大值4.70%。90～105 min時蛋白提取率下降。主要是由于浸提時間達90 min時，蛋白溶出已達到飽和狀態，攪拌時間過長，部分蛋白發生水解，蛋白提取率反而降低。因此選擇浸提時間90 min進行后續試驗。

2.5 響應面試驗

2.5.1 響應面試驗設計

根據提取苦蕎麥球蛋白單因素試驗結果，由Design-Expert 8.0.6軟件設計出的試驗方案及結果見表2。

表2 苦蕎麥球蛋白提取條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests for extraction condition optimization of globulin from tartary buckwheat

2.5.2 回歸方程及方差分析

通過表2的試驗數據，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行擬合，得如下回歸方程：R=5.72+0.30A-0.070B+0.33C+0.20D-0.42AB-0.047AC-0.027AD-0.66BC+0.013BD-0.26CD-0.64A2-0.70B2-0.54C2-0.57D2

對于上述回歸模型進行方差分析，并對模型系數進行顯著性檢驗，結果如表3。F值來檢驗各變量對響應值影響的顯著性的高低，P越小，則相應變量的顯著程度越高，而失擬項P＞0.05不顯著。由表3方差分析結果可知，模型F=71.26，P＜0.000 1表明差異極顯著，并且失擬項P=0.564 9＞0.05，說明該模型顯著。模型決定系數R2=0.986 2，說明擬合程度很好，且調整決定系數R2adj=0.972 3，預測決定系數R2pre=0.937 3，方差相差很小，說明可信度高，可以用此模型來分析和預測蛋白提取率最優提取工藝。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，鹽含量、料液比、溫度和時間對蛋白提取率影響均顯著（P＜0.05）；各因素對蛋白提取率影響程度為C＞A＞D＞B。對于交互作用來說，鹽含量和料液比、料液比和溫度以及溫度和時間交互作用對球蛋白提取率的影響顯著（P＜0.05），鹽含量和溫度、鹽含量和時間以及料液比和時間交互作用對球蛋白提取率的影響不顯著（P＞0.05），對于模型的二次項來說均極顯著。

2.5.3 響應面結果分析

響應面圖可以更加直觀形象的反映出各單因素以及各單因素之間交互影響的強弱關系。響應面中，固定某個因素，改變另一個因素引起響應值變化，如果響應面走勢較陡，說明該因素對響應值影響顯著，反之則不顯著。響應面優化模型因素（鹽含量、料液比、浸提溫度和浸提時間）交互作用對球蛋白提取率影響的響應面圖和等高線圖如圖5。

由圖5分析可知，鹽含量和料液比交互作用對蛋白提取率影響的等高線圖為橢圓形，說明鹽含量和料液比交互作用對蛋白提取率影響顯著。當料液比不變時，隨著鹽含量的增加，蛋白提取率呈現先上升后下降的趨勢。同樣，當鹽含量不變時，隨著料液比增加，蛋白提取率也呈現先增加后減小的趨勢，且變化較為明顯。當鹽含量為1.05%，料液比為1∶14（g∶mL）左右時蛋白提取率達到最大值。

鹽含量和浸提溫度以及鹽含量和浸提時間交互作用對蛋白提取率的影響的等高線圖都接近圓形，說明對結果的影響不顯著。雖然影響不顯著，但當固定一個變量，蛋白提取率會隨著另一個變量的增大先上升后下降，但是變化不是很大。當鹽含量為1.05%，浸提溫度為51 ℃，浸提時間為90 min附近達到最大值。

圖5 鹽含量、料液比、浸提溫度、浸提時間交互作用對苦蕎麥球蛋白提取率影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between salt content,material-liquid ratio,extraction temperature and time on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

料液比和浸提溫度對蛋白提取率影響的等高線圖為橢圓形，說明對結果的影響較為顯著。當料液比不變時，隨著浸提溫度的增加，蛋白提取率呈現明顯上升的趨勢。但是當浸提溫度不變時，隨著料液比增加，蛋白提取率先迅速增加，然后出現少量的減小，且變化較為明顯。在浸提溫度為53 ℃，料液比為1∶13（g∶mL）附近達到最大值。

料液比和浸提時間交互作用對蛋白提取率的影響的等高線圖近似圓形，說明對結果的影響不顯著。隨著因素的變化，蛋白提取率變化趨勢為拋物面，在料液比1∶15（g∶mL），浸提時間為90 min取得最大值。

浸提溫度和浸提時間交互作用對蛋白提取率的影響，等高線圖為較扁的橢圓形，說明對蛋白提取率的影響較為顯著。隨著因素的增加，蛋白提取率先增加，在浸提溫度為51 ℃，浸提時間為90 min左右達到最大值，然后蛋白提取率出現小量下降，且隨著因素的變化，結果變化明顯。

響應面圖均為開口向下的凸面，故響應值R存在極大值，為進一步優化結果，根據Design-Expert軟件得出在鹽含量、料液比、浸提溫度和浸提時間交互影響下，最優提取工藝為：鹽含量為1.07%，料液比為1∶12.73（g∶mL），浸提溫度為52.54 ℃，浸提時間為89.50 min，在此條件下模型預測的蛋白提取率為5.87%。

2.5.4 驗證試驗

據所建立的數學模型進行參數最優分析，得到最佳預測工藝條件為：鹽含量為1.07%，料液比為1∶12.73（g∶mL），浸提溫度為52.54 ℃，浸提時間為89.50 min，在此條件下模型預測的蛋白提取率為5.87%。考慮實際操作，修改條件為鹽含量1.00%、料液比1∶13（g∶mL）、浸提溫度為50 ℃、浸提時間為90 min，在此條件下，得出蛋白提取率為5.60%，與預測值5.87%接近，說明該模型能較好地預測實際蛋白提取率。

3 結論

本研究結果表明，在單因素試驗基礎上，采用4因素3水平的響應面分析方法，以鹽含量、料液比、攪拌時間、攪拌溫度為試驗因素，以球蛋白提取率為響應值，試驗中苦蕎麥鹽溶性球蛋白的最佳提取工藝條件為鹽含量1.00%、料液比1∶13（g∶mL），浸提時間90 min，浸提溫度50 ℃，在此條件下蛋白提取率為5.60%。苦蕎麥蛋白是調節人體生理功能的良好食品，食品界與醫藥界都有相關研究，且日益受到人們的關注。本研究結果為解決苦蕎麥在食品和醫藥界的應用提供思路，為高效制備苦蕎麥球蛋白提供依據。