基于體外實驗探討補陽還五湯對血管新生的影響

龐曉麗，劉建衛，李虎虎，楊 琳，王青龍

血管新生是以內皮細胞增殖、遷移和成管為特征的復雜過程，常在營養和氧氣供應不足時發生，且受多種促血管生成因子如血管內皮細胞生長因子(VEGF)、重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等調控，VEGF在血管新生中具有重要作用[1-2]。補陽還五湯為傳統中藥方劑，常被用于治療腦血管疾病[3]。現代科學研究顯示，補陽還五湯對腦缺血損傷的保護作用與促進血管新生有關[4-5]。然而該方劑對血管新生的影響及作用機制尚未完全闡明。因此，本研究以血管段、內皮細胞為研究對象，從體外實驗探討補陽還五湯對血管新生的影響，為補陽還五湯治療缺血性損傷提供體外實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 補陽還五湯首載于《醫林改錯》，組方：黃芪120 g，當歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g。飲片購自北京同仁堂。鼠尾膠、MCDB131培養基、DMEM培養基、細胞計數8(CCK-8)、青霉素鏈霉素、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA、Trizol、Ⅰ型膠原和羧甲基纖維素等均購自Gibco(美國)公司；RNA反轉試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自北京天根生化技術有限公司。引物由Sangong生物技術公司(上海)合成。VEGF等抗體購自Santa Cruz生物技術公司(美國)。

1.2 實驗動物和細胞 初斷乳雄性SD 大鼠，體重約80 g，6周齡雄性SD大鼠，體重約 200 g，均購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所[合格證號 SCXK(京)2014-0004]，經天津中醫藥大學動物管理和使用委員會批準。人腦微血管內皮細胞(HBMECs)購自美國Sciencell公司。

1.3 補陽還五湯載藥血清制備 將雄性6周齡SD大鼠，按人和大鼠用藥等效劑量換算(200 g大鼠對應70 kg成人的體表面積系數0.018，故200 g大鼠每天服用生藥量為2.565 g)。課題組前期體內實驗確定低、中、高劑量分別為等效劑量的0.5倍、1.0倍、2.0倍，故以此為基礎分為補陽還五湯低、中、高劑量組，分別以低、中、高劑量進行灌胃，正常組則給予等體積生理鹽水灌胃。各組每日灌胃1次，持續1周，于末次灌胃后2 h，腹主動脈無菌取血、分離血清，滅活后于-20 ℃保存備用。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 體外血管新生三維培養模型的構建 參照Zhu等[6]研究體外構建三維培養血管新生模型。7%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉初斷乳SD 大鼠后，75%乙醇浸泡10 min，超凈臺內快速打開胸腔，剪開右心耳，以預冷的D-hank′s 液進行心臟灌流至流出液無色為止，切取約2 cm 胸主動脈，在預冷的D-hank′s 液中除去外膜，用手術刀切成1 mm 厚血管環，置于鋪pH7.4鼠尾膠和MCDB131 混合培養基質的96 孔板內，37 ℃凝固20 min 后取出，在培養物上層再加入混合基質，37 ℃再次凝固20 min，于上層加入含10%胎牛血清的DMEM 培養液，培養72 h后。將培養的血管段分為對照組、補陽還五湯組(低劑量、中劑量、高劑量)，對照組加入10%空白鼠血清，補陽還五湯組加入10%不同劑量補陽還五湯載藥血清，培養72 h后在倒置顯微鏡下觀察血管新生情況。

1.4.2 細胞活力測定 將HBMECs(5 000個)培養3～5代后將其接種于96孔板中，繼而將其分為對照組、模型組、模型+補陽還五湯組(低劑量、中劑量、高劑量)。對照組給予10%空白鼠血清；模型組參考王波等[7]研究方法，通過氯化鈷(CoCl2)建立內皮細胞缺氧模型，并給予10%空白鼠血清；模型+補陽還五湯組給予10%不同劑量補陽還五湯載藥血清。37 ℃培養箱培養24 h，采用CCK-8方法檢測細胞活力。

1.4.3 劃痕遷移試驗 將HBMECs(1×105個)接種于24孔板中，同步化后用0.2 mL吸管尖端在培養板中間劃“+”字，繼而將其分為對照組、模型組(CoCl2致缺氧)、模型+補陽還五湯組。對照組和模型組均給予10%空白鼠血清，模型+補陽還五湯組則基于細胞活力測定實驗，選擇有統計學意義的10%補陽還五湯載藥血清干預。采用倒置顯微鏡拍攝，通過測量劃痕傷口邊緣的相對距離來評估細胞遷移情況。

1.4.4 三維細胞培養 參照劉少坤等[8]研究方法，將HBMECs(1×106個)接種于非貼壁96孔板中培養，直至細胞形成多個球狀體。將細胞小球與含體積分數10%新生小牛血清的Ⅰ型膠原(1.5 g/L)-甲基纖維素(1∶1)混合液中混勻后，移入24孔板中(每孔1 mL；每孔20～30個細胞球)并置于37 ℃、5%CO2的培養箱30 min。待混合物形成膠狀結構后，每孔分別加入200 μL含有20 ng/mL的VEGF和/或不含10%補陽還五湯大鼠血清的培養基。繼而將接種好的細胞球分為對照組和補陽還五湯組。對照組給予10%空白鼠血清，補陽還五湯組則基于細胞活力測定實驗，選擇有統計學意義的10%補陽還五湯載藥血清干預。在倒置顯微鏡下觀察內皮細胞的管狀結構，并分別于24 h、48 h和72 h內在放大40倍情況下拍照。

1.4.5 反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析 將HBMECs(2×106個)接種于6孔板中，將其分為對照組、模型組(CoCl2致缺氧)、模型+補陽還五湯組。對照組和模型組均給予10%空白鼠血清，模型+補陽還五湯組則基于細胞活力測定實驗，選擇有統計學意義的10%補陽還五湯載藥血清干預。24 h后采用Trizol法提取補陽還五湯載藥血清干預后的HBMECs細胞總RNA，繼而采用RT試劑盒反轉成cDNA。基于設計好的引物(VEGF，5′-3′端GCTACTGCCATCCAATCGAG，3′-5′端TGCATTCACATTTGTTGTGC)根據PCR說明書，以25 μL作為反應體系進行檢測，以雙Δ法計算VEGFmRNA相對表達變化。

2 結 果

2.1 主動脈血管段新生血管情況 各組均有不同程度的血管新生，補陽還五湯各劑量組新生血管數量較對照組增加，尤以高劑量組最為明顯。詳見圖1。

圖1 各組主動脈血管段新生血管情況(光鏡，×100)

2.2 HBMECs增殖情況 采用CoCl2建立內皮細胞缺氧模型。如圖2所示，以250 μmol/L CoCl2對內皮細胞損傷開始出現統計學意義，故本研究采用此濃度構建內皮細胞缺氧模型，造模后給予補陽還五湯載藥血清干預。結果顯示補陽還五湯干預后細胞活力明顯增強，且與劑量呈正相關(見圖3)。因此，后續實驗均采用高劑量載藥血清進行干預。

與0 μmol/L比較，*P<0.05，ΔP<0.01。

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.3 HBMECs遷移情況 在血管新生過程中，內皮細胞遷移是必不可少的過程。本研究通過劃痕實驗評價補陽還五湯對內皮細胞遷移的影響，基于內皮細胞增殖實驗，劃痕實驗中補陽還五湯組選擇高劑量組作為藥物干預組；對照組為正常條件下培養0～10 h，模型組和補陽還五湯組采用CoCl2(250 μmol/L)進行化學缺氧造模，繼而在不同濃度載藥血清(0和10%)條件下孵育0～10 h。結果顯示補陽還五湯能有效促進內皮細胞遷移。詳見圖4。

圖4 各組內皮細胞遷移情況(光鏡，×100)

2.4 內皮細胞成管情況 基于三維培養以圖5A中血管計數方法為標準，統計血管數量。結果顯示補陽還五湯載藥血清干預后，與對照組比較管腔數量明顯增加；在維持時間上，對照組在72 h管腔開始退化，而補陽還五湯組管腔結構正常(見圖5B)。詳見圖5。

圖5 各組對內皮細胞成管的影響(光鏡，×40)

2.5 VEGF mRNA表達情況 RT-PCR結果顯示，與模型組相比，補陽還五湯組可以促進VEGF表達(P<0.01)。詳見圖6。

與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，# P<0.01。圖6 各組VEGF mRNA表達比較

3 討 論

血管新生對于缺血性組織損傷性疾病的恢復，如缺血性腦卒中、心肌梗死等至關重要[1]。新生血管不僅可以為組織提供氧氣，還可以恢復細胞代謝，進而改善組織功能。補陽還五湯為治療腦卒中之名方，該方由黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁組成，活血而不傷正，能使虧損之氣得以補還，因虛致瘀之血得以運行，共奏補氣活血通絡之效，對心腦血管疾病療效確切[9]。現代醫學研究證明補陽還五湯對腦缺血損傷的保護作用與促進血管新生有關[10-11]。

為進一步闡明補陽還五湯對血管新生的影響，本研究首先構建血管段三維培養模型，判斷補陽還五湯對血管新生的作用。結果表明，補陽還五湯能促進主動脈環的血管新生反應，說明該方劑對血管新生有影響。如前所述，血管新生常在缺血缺氧情況下發生，是一個從已有血管中建立新血管的復雜過程，主要包括內皮細胞增殖、遷移、出芽形成新的血管網等步驟[1-2]。故本研究以內皮細胞為研究對象，進一步探討補陽還五湯對血管新生的影響。結果顯示，補陽還五湯可明顯促進內皮細胞增殖、遷移和成管。

眾所周知，內皮細胞增殖、遷移和成管受一系列血管生長因子調控[1]。其中VEGF作為最具代表的血管新生調控因子之一[2，12]，可與內皮細胞表面受體VEGF受體2(VEGFR 2)結合激活酪氨酸激酶，進而啟動一系列事件，包括磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和RAF/MEK/ERK信號通路，最終刺激內皮細胞增殖、遷移和成管[13-14]。研究顯示通過阻斷VEGF受體或抑制VEGF的產生可明顯減少血管新生[15]。本研究結果顯示，補陽還五湯能促進內皮細胞VEGF表達。因此，推測補陽還五湯對血管新生的作用與促VEGF表達有關。

總之，本研究從體外角度探討補陽還五湯對血管新生的影響。雖然闡明該方劑促血管新生與調控VEGF有關，但具體信號通路還需進一步研究。