黃喉擬水龜Dmrt1基因克隆及其表達特征

歐陽淑 劉曉莉 王亞坤 李 偉 朱新平, 2

(1.中國水產科學研究院珠江水產研究所,農業農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室,廣州 510380;

2.上海海洋大學,上海 201306)

性別是生命科學的重大命題之一,性別決定及其調控機制一直是遺傳學、發育生物學和進化生物學的前沿和熱點科學問題之一[1—4]。脊椎動物主要有遺傳型性別決定(Genetic sex determination: GSD)和環境型性別決定(Environmental sex determination: ESD)[5—7]兩種性別決定方式。目前在動物中關于性別決定機制的研究已取得一定進展,脊椎動物中最早鑒定出的性別決定基因是人類的Sry基因(sex-determining region Y)[8],隨后其他一些性別決定基因或性別決定候選基因也相繼被研究者發現,如青鳉(Oryzias latipes)中的Dmy基因[9]、非洲爪蟾(Xenopus laevis)中的DM-W基因[10]、雞和半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)中的Dmrt1基因[11,12]、青鳉(Oryzias luzonensis)的Gsdfy基因[13]、河豚(Takifugu rubripes)中的Amhr2基因[14]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的sdY基因等[15]。除了遺傳型性別決定基因,一些環境型性別決定和性別分化相關基因的研究也取得了一定的進展,如在龜(Chelydra serpentina)中發現的溫度依賴型性別決定候選基因CIRBP[16],及在其他溫度依賴型性別決定爬行動物熱敏期鑒定的一系列性別決定和性別分化相關基因Dmrt1、Sf1、Rspo1、foxl2等[17]。然而,相對于遺傳型性別決定基因的廣泛研究,許多環境型性別決定物種的性別調控機制目前還并不是十分清楚。

龜鱉類動物在動物系統進化過程中處于承前啟后的地位,其性別決定類型和機制極其豐富[18],因而龜鱉類性別決定的遺傳基礎及其調控機制的研究一直廣受關注。許多龜鱉類在生長和個體大小等重要經濟性狀上具有顯著的性別異性,黃喉擬水龜和中華鱉等雄性個體的生長速度比雌性個體快[19,20],而三線閉殼龜和烏龜在雌性個體中的生長速度比雄性個體快[21]。因此,在深入了解龜鱉類性別決定機制的基礎上,對龜鱉類性別發育的操控在龜鱉類育種領域也具有重大的應用價值。

黃喉擬水龜(Mauremys mutica)別稱石龜或石金錢,在國外主要分布在越南和日本[22,23],在我國主要分布在廣西、廣東、海南、福建等地[24]。黃喉擬水龜產卵的時間一般是每年的4—8月[25],其在生長性狀上具有明顯的性別異型[20]。此外,黃喉擬水龜在高溫條件下孵育產生偏雌性子代,在低溫條件下孵育產生偏雄性子代,這種性別決定類型為溫度依賴型性別決定[26],屬于TSD Ia型。黃喉擬水龜性別決定的機制尚不清楚,本研究利用黃喉擬水龜雌雄性腺轉錄組篩選和克隆性別調控相關基因Dmrt1 cDNA全長序列,通過實時定量PCR分析Dmrt1轉錄本在成體黃喉擬水龜性腺及胚胎發育時期表達的特征,利用化學原位雜交檢測了黃喉擬水龜Dmrt1基因在雄性性腺中的表達。本研究結果為了進一步解析黃喉擬水龜性別決定機制提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究從中國水產科學研究院珠江水產研究所野生動物繁育基地選取成年黃喉擬水龜及受精卵,從中分別選取3冬齡雌、雄黃喉擬水龜各9只。用無酶剪刀剪取心、腎、眼、肝、脾、腦、肌肉、卵巢、精巢等各組織,保證全程無菌操作并迅速將樣品放置于TriPure isolution Reagent(Trizol,賽默飛世爾科技公司,廣州)中,保存于-80℃冰箱備用;另取一部分性腺組織浸于4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)中進行固定,然后用甲醇對樣品進行梯度脫水處理并放置-20℃冰箱中保存備用于切片。

收集來自黃喉擬水龜所產的受精斑明顯的龜卵,將受精卵埋入濕度適宜且混合均勻的蛭石中。孵育過程在恒溫孵化箱進行孵化,孵化全程空氣濕度恒定,為80%。孵化條件分別設置為25(±0.5)℃和32(±0.5)℃,其中每個孵化溫度共孵育120枚受精卵。當胚胎發育至14期時,將32℃孵化下的50枚受精卵轉至25℃孵化,再將25℃孵化下的50枚受精卵轉至32℃孵化。分別取25℃、32℃、25℃轉到32℃、32℃轉到25℃等不同孵化溫度下性腺不同發育階段(14期、16期、19期、22期、25期)的樣品,每個發育時間點取10枚受精卵,將取的性腺樣品置于-80℃冰箱中超低溫保存,所取組織將用于RNA提取,各個發育時期的確定參照先前的報道[27]。

1.2 黃喉擬水龜Dmrt1基因cDNA克隆

總RNA提取與cDNA合成用Trizol法提取黃喉擬水龜成體各個組織樣品、不同發育階段的受精卵性腺的總RNA并用DNA酶Ⅰ(威佳科技有限公司,廣州)去除基因組DNA污染。本實驗為了檢測RNA 的完整性、濃度及純度,分別進行了瓊脂糖凝膠電泳和NanoQTM紫外分光光度計檢測。

Dmrt1基因cDNA克隆根據本實驗室已有的黃喉擬水龜雌雄性腺轉錄組數據,通過基因注釋篩選出轉錄組中的黃喉擬水龜Dmrt1基因序列,設計特異性上下游引物Dmrt1-F1和Dmrt1- R1以性腺組織(精巢和卵巢)的cDNA為模板擴增黃喉擬水龜Dmrt1片段(表1)。反應條件如下: 94℃預變性2min;94℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 120s,33個循環;72℃延伸10min;4℃。用雄性黃喉擬水龜精巢總RNA,以SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech,

美國)合成5′-RACE和3′-RACE cDNA的第一條鏈,以合成5′-RACE和3′-RACE 的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增,分別合成Dmrt1 5′UTR及3′UTR,所用引物如表1所示。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的條帶后用pMD19-T載體(TaKaRa)進行連接,再利用DH5α感受態細胞進行轉化、克隆和篩選,最終獲得的陽性克隆由廣州天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

黃喉擬水龜Dmrt1基因序列分析使用DNAstar將5′-RACE、3′-RACE及Dmrt1片段拼接,使用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測ORF及氨基酸序列。分別對核苷酸序列及氨基酸序列進行比對通過NCBI庫中的BLASTN軟件和BLASTP軟件。最后通過MEGA 6,再利用鄰近法(Neighbour-joining,NJ)進行構建系統進化樹,采用自舉法(Bootstrap,Felsenstein 1985)1000次來檢驗樹中各節點的置信度。

表 1 本研究所用引物序列Tab.1 Primers and their sequences used in this experiment

1.3 組織特異性分析

利用測序所得黃喉擬水龜Dmrt1 cDNA的序列進行特異性上下游引物的設計(表1),本實驗以Gapdh基因為內參基因,以此來設計上下游引物Gapdh-F和Gapdh-R(表1)。以成體黃喉擬水龜卵巢、精巢、心、肝、脾、腎、肌肉、眼、腦組織及25℃和32℃性腺不同發育階段提取總RNA并轉錄合成的cDNA為模板進行 RT-qPCR,每組樣品至少重復檢測3次。使用Applied Biosystems Step One Plus Real-Time PCR Systems進行擴增反應,采用2-??Ct法來計算相對表達量。RT-qPCR反應條件如下所示: 95℃ 3min;95℃ 15s,60℃ 30s,72℃ 30s,40個循環;其中95℃ 15s,60℃ 30s,95℃ 15s為溶解曲線的程序。本實驗采用SPSS統計分析軟件并通過Duncan’s法進行多重分析比較,其中當P＜0.05 時表示差異顯著。

1.4 細胞定位分析

RNA探針制備使用ApaⅠ和SacⅡ限制性內切酶分別線性化含黃喉擬水龜Dmrt1 cDNA片段的質粒,回收產物依照SP6/T7 Enzyme Mix(Invetrogen)digoxigenin(DIG)RNA Labeling 試劑盒(Roche)合成正(檢測目標信號)、反義探針(陰性對照),并用Licl(Invetrogen)沉淀法純化探針備用,具體步驟參考相關文獻[28]。

冰凍切片化學顯色原位雜交(AP)分析將所取組織置于固定液中進行固定過夜,第二日固定后用酒精進行梯度脫水再將組織置于蔗糖溶液中并進行包埋和冰凍切片處理(厚度約4—5 μm),最后置于45℃烘箱中30min,再參照化學顯色原位雜交方法操作本實驗。本實驗原理為通過鼠抗地高辛標記并與探針進行結合,再進行顯色反應,最后AP陽性顯淺紫色,用PI復染細胞核顯紅色。

2 結果

2.1 黃喉擬水龜Dmrt1基因的序列克隆及分析

本研究通過PCR克隆獲得了長度為1811 bp的黃喉擬水龜Dmrt1 cDNA序列,其中包括5′端的非編碼區129 bp,3′端的非編碼區572 bp及開放閱讀框1110 bp,具有保守polyA序列,共編碼370個氨基酸(GenBank登錄號: MT363640)。

氨基酸序列同源性比對顯示黃喉擬水龜Dmrt1與紅耳龜(Trachemys scripta)的同源性最高,達97.57%;與龜鱉類中西部錦龜(Chrysemys picta)和草龜(Mauremys reevesii)同源性次之,分別為97.30%和96.77%;與中華鱉(Pelodiscus sinensis)Dmrt1同源性為75.54%;而小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的同源性依次為63.25%和63.16%;其與魚類如中華鱘(Acipenser sinensis)的同源性較低,為21.62%。系統進化樹結果(圖1)顯示: 黃喉擬水龜與草龜、紅耳龜、西部錦龜、中華鱉親緣關系最近,聚為一個小的分支,接著是與鱷類及鳥類親緣關系較近,最后依次與哺乳類、兩棲類及魚類聚為一個分支,與魚類親緣關系最遠。因此,Dmrt1系統進化樹的分支和物種的進化關系基本一致。

2.2 黃喉擬水龜Dmrt1 mRNA的組織表達分析

本研究選用的內參基因為Gapdh基因[29],通過實時熒光定量PCR對成年雌雄黃喉擬水龜心、肝、脾、腎、眼、腦、肌肉、卵巢、精巢進行Dmrt1的組織表達分析。定量結果顯示雌雄黃喉擬水龜Dmrt1在心、肝、脾、腎、眼、腦、肌肉等組織中表達均極低,在卵巢中表達量較少,但在精巢中呈現高度表達狀態,且表達量顯著高于其他組織(圖2)。

2.3 黃喉擬水龜胚胎發育各時期Dmrt1 mRNA在性腺中的特異性表達分析

實時熒光定量PCR結果顯示,產雄溫度(25℃)以及從32℃轉移到25℃下黃喉擬水龜Dmrt1基因在性腺分化啟動前的第19期(圖3C、圖3H)雄性特異性開始表達,且在胚胎發育后期的22期(圖3D、圖3F、圖3H)及25期(圖3E、圖3H)一直維持較高的表達水平,而在產雌溫度(32℃)以及從25℃轉移到32℃下各個胚胎發育時期的表達水平均較低(圖3G、圖3H)。

2.4 黃喉擬水龜Dmrt1基因 mRNA在精子發生過程中的表達分布

化學顯色原位雜交結果顯示,在3齡黃喉擬水龜精巢中,Dmrt1 mRNA信號在主要在支持細胞中表達,在精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞中有少量表達,在精子和精細胞中幾乎不表達(圖4)。

3 討論

脊椎動物性別調控機制的研究對于性控育種、物種保護及物種繁育具有顯著應用價值。溫度依賴型性別決定(TSD)是環境型性別決定的主要類型,在龜類(turtles)、蜥蜴(Pogona vitticeps)、鱷魚(Alligator mississippiensis)、壁虎(Eublepharis macularius)等爬行動物中廣泛存在。目前,相對于遺傳型性別調控機制研究的深度,溫度依賴型性別決定及性別分化的分子機制尚不是很清楚。

前期研究表明,Dmrt1基因是擁有保守DNA結合區域(DM domain)的雄性決定調控因子,在脊椎動物精巢分化和發育過程中作用很大[30,31]。在具有ZZ/ZW性別決定系統的鳥類如雞中,Dmrt1在雄性個體的表達量遠高于雌性個體,且通過RNA干擾技術將Dmrt1基因沉默后,會導致ZZ基因型的胚胎表現出雌性性狀,表明Dmrt1基因與雞的精巢分化有著密不可分的關系[12]。在雌核生殖的多倍體銀鯽(Carassius gibelio)中Dmrt1基因主要在支持細胞中表達,在精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞中也有少量表達,說明早期表達的Dmrt1可能與雄性生殖細胞決策和精子發生起始相關聯[32],這與哺乳動物中Dmrt1在未分化和正在分化的精原細胞中的表達模式相類似,決定了精原細胞是進入減數分裂還是有絲分裂[33]。本研究通過RACE-PCR克隆得到了黃喉擬水龜Dmrt1基因的全長cDNA序列,系統進化樹分析結果表明其與紅耳龜(Trachemys scripta)、西部錦龜(Chrysemys picta)和草龜(Mauremys reevesii)的親緣關系較近,與魚類親緣關系較遠(圖1),且具有保守性極高的DM結構域。通過反轉錄實時定量PCR對成年黃喉擬水龜Dmrt1基因的組織差異表達分析,結果顯示在黃喉擬水龜雌雄成年個體的不同組織中,Dmrt1基因在精巢中呈現極高的表達量,并且顯著高于卵巢及其他體組織(圖2)。化學原位雜交結果顯示Dmrt1 mRNA信號主要集中在支持細胞中,在初級精母細胞、次級精母細胞中信號較弱,而在精細胞和精子中未檢測到信號。Ge等[34]在發現支持細胞的細胞核上,紅耳龜(Trachemys scripta)DMRT1蛋白有表達,對Dmrt1基因進行敲低處理后,雄性特異性Sox9的表達量隨著雄性胚胎組織特征雌性化而顯著降低[34]。以上研究表明,Dmrt1是廣泛參與脊椎動物性別決定和性腺的分化過程的重要調控基因。

圖1 Dmrt1基于鄰接法構建的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed through the neighbor-joining method

圖2 Dmrt1基因多組織tissues轉錄本的組織特異性表達Fig.2 The mRNA expression of Dmrt1 in multiple tissues

圖3 Dmrt1基因在胚胎發育各時期性腺組織中的特異性表達Fig.3 The expression of Dmrt1 gene in gonad tissues at different stages of embryonic development

在脊椎動物的系統進化過程中,遺傳性別決定和環境性別決定這兩種看似差異顯著的性別決定方式往往并不是對立的,在銀漢魚(Odontesthes bonariensis)中遺傳型性別決定和環境依賴型性別決定同時存在[35],在澳大利亞松獅蜥(Pogona vitticeps)中通過性逆轉能夠促使遺傳型性別決定迅速向溫度依賴型性別決定轉變[36]。一些遺傳型性別調控基因如Amh、Sox9等在環境型性別決定物種如紅耳龜中也呈現出雌雄差異性表達,表明這些保守性基因及其介導的信號級聯通路有可能在環境型性別決定物種中同樣存在。在本研究中,我們發現Dmrt1在黃喉擬水龜產雄溫度(25 ℃)下性腺分化的第16期中就已開始表達,此外相較于雌性性腺,Dmrt1在不同發育時期雄性性腺中呈現高特異性表達,當把胚胎由產雌溫度轉移到產雄溫度時,Dmrt1表達量又急劇上升(圖3),表明Dmrt1基因可能是參與了黃喉擬水龜早期雄性性腺分化過程。在其他龜鱉類如中華鱉(Pelodiscus sisinensis)中,Dmrt1在其雄性性腺分化之前的16期便開始特異表達,且其表達受雌激素的影響[37]。且在紅耳龜(Trachemys scripta)中,相較于Sox9和Amh基因,Dmrt1基因在雄性性腺中的表達要更早,說明Dmrt1處于溫度依賴型性別決定信號通路的上游位置,并且介導了下游一些與性別調控相關基因的表達,在異型性性腺向精巢分化過程中扮演了重要角色。

圖4 Dmrt1 轉錄本在精巢中的表達Fig.4 The Dmrt1 mRNA expression in testis

綜上所述,Dmrt1可能是黃喉擬水龜早期雄性分化過程中的關鍵調控基因,然而,由于龜鱉動物中基因編輯技術的缺乏,使得我們對于黃喉擬水龜性別調控相關基因功能的研究有限。本實驗室目前已進行了黃喉擬水龜性腺細胞的分離及體外培養,獲得了生長良好且能穩定傳代培養的精巢和卵巢細胞系(未發表數據),為后續對Dmrt1等性別調控相關基因功能的探索以及溫度調控性別的分子機制奠定了基礎。