基于Miseq測序技術分析黃顙魚不同養殖模式下池塘微生物群落結構多樣性

王一亭 李 波 王厚紅 吳法龍 張 磊

(1.中國科學院水生生物研究所中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室，武漢 430072;2.中國科學院水生生物研究所淮安研究中心，淮安 223002;3.武漢市農業科學院，武漢 430207;4.淮安市洪澤區三河鎮農業技術服務站，淮安 223124)

微生物群落是養殖生態系統的重要組成部分[1],其在一定程度上決定養殖生態系統的穩定性[2],并能夠較好地指示養殖環境健康狀況[3],因此,通過養殖環境微生物群落結構的研究來比較不同養殖模式對養殖環境及魚類健康的影響受到越來越多學者的關注[4,5]。

黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco(Richardson)是典型的底棲雜食性魚類,是我國重要的水產養殖品種。近年來,我國黃顙魚養殖產業發展迅速,據《2018年中國漁業統計年鑒》,2017年全國黃顙魚總產量超過48×107kg,產量位居淡水名優魚類第三。目前,黃顙魚養殖模式以黃顙魚單養、黃顙魚混養草魚及黃顙魚混養草魚、鳙、鰱三種養殖模式最為常見。草魚是典型的草食性魚類,有助于清除池塘雜草;鰱、鳙是典型濾食性魚類,在控制水體生態環境及水質健康中起重要作用[6,7]。通過比較黃顙魚不同養殖模式下池塘水體及底泥中微生物的群落結構及差異,有助于掌握不同養殖模式環境微生物群落結構的變化規律,從而有效調整或改進現有養殖模式。高通量測序(HTS)技術由于其快速、準確、數據量大的優點,被廣泛應用到動物個體微生物及環境微生物基因組學、功能基因組學的研究中[8,9]。對全面分析樣本的微生物群落多樣性等意義重大[10]。本研究基于構建16S rDNA基因測序的方法,分析黃顙魚不同養殖模式下池塘養殖水體及底泥中微生物群落結構及差異,旨在探討三種養殖模式下環境微生物組成及變化規律,為黃顙魚生態綠色健康養殖模式開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗池塘及實驗魚

實驗池塘位于江蘇省淮安市淮陰區水產良種場,選擇9個標準化養殖池塘,每個池塘面積為6666.7 m2,水深2.2 m,進排水方便。池塘水引自同一進水渠(水源為運河水),池底淤泥約30 cm,底質一致性良好。在實驗期間,水溫為自然水溫。實驗所用魚苗由中國科學院水生生物研究所淮安研究中心自行繁殖的同批次魚苗,實驗飼料由潛江加益加水產飼料有限公司生產,飼料蛋白含量為40%。

1.2 實驗設計

實驗分為黃顙魚單養組A、黃顙魚草魚混養組B、黃顙魚草魚鰱鳙混養組C三種養殖模式,每種養殖模式分別由3個獨立的養殖池塘進行實驗(即每種養殖模式3個重復)。每種魚類的放養平均質量及放養密度為: 黃顙魚(8.20±0.10) g、15 ind./m2,草魚(10.03±0.04) g、0.05 ind./m2,鰱(9.85±0.11) g、0.04 ind./m2,鳙(11.56±0.32) g、0.03 ind./m2。實驗時間為2017年8月至11月,共84d。實驗期間每天定時投喂2次(9:00和16:00),每次投喂量約為黃顙魚魚體總重的4%,視黃顙魚吃食情況適量增減投喂量,并記錄。

1.3 樣品采集和處理

實驗開始、結束時分別對池塘養殖水體及底泥取樣1次。水樣采用5 L采水器分別在池塘的中央和4個角水面下50 cm處采集,并將5個點的水樣混合后取2 L帶回實驗室待測。在水樣沉淀后,取上清液通過0.22 μm微孔濾膜真空過濾,將過濾后的濾膜保存在5 mL離心管中,液氮速凍3—5min,然后轉移至-80℃冰箱中保存待測。泥樣采集用彼得森采泥器分別在池塘中央和4個角采集水底表層泥,混合后裝入無菌收集瓶。泥樣帶回實驗室后分裝至 5 mL離心管中,液氮速凍3—4h,然后轉移至-80 ℃冰箱中保存待測。樣品命名見表1。

1.4 樣品DNA提取

水樣中微生物DNA提取,取出樣品濾膜充分剪碎(使樣品表面菌群更好的與裂解液接觸),置于1.5 mL滅菌離心管中,加入裂解液,使其釋放DNA,隨后使用E.Z.N.A.TMWater DNA Kit(Omega,美國)試劑盒提取;泥樣中微生物DNA提取使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(Omega,美國)試劑盒,具體方法見試劑盒說明書。

1.5 PCR擴增及測序分析

本研究選擇細菌16S rDNA V3-V4可變區作為目的擴增片段,進行后續高通量測序,采用16S rDNA V3-V4區通用引物341F/805R。引物序列為:341F: 5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′,805R: 5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA ATTCCA-3′,同時在3′端添加Barcode區分序列樣品。

擴增V3-V4可變區采用30 μL PCR體系。PCR體系為: 2×Taqmaster Mix 15 μL,primer F(10 μmol/L)1 μL,Primer R (10 μmol/L) 1 μL,DNA模板 10—20 ng,添加去離子水至30 μL。

PCR條件為: 95℃變性3min;94 ℃變性20s,55℃退火20s,72℃延伸30s,擴增25個循環;最后于72℃延伸5min。擴增后PCR產物經純化后,交生工生物工程有限公司(上海)進行Miseq(Illumina)高通量測序。

表 1 水樣及泥樣具體命名表Tab.1 List of names of water samples and mud samples

1.6 數據分析

Illumina Miseq測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別(Base Calling)分析轉化為原始測序序列(Raw Reads),根據barcode區分每個樣本,并對序列質量進行質控和過濾;根據overlap關系進行拼接,拼接后的序列再次進行質控和過濾,最后得到優化序列,進行下游分析。優化序列進行OTU 聚類分析和物種分類學分析。

OTU(操作分類單元,Operational Taxonomic Units)是在系統發生學或群體遺傳學研究中,為了便于進行分析,人為給某一個分類單元(品系,屬,種、分組等)設置的同一標志。根據不同的相似度水平,對所有序列進行OTU劃分,本研究在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。

2 結果

2.1 序列豐度

對測序所得的序列進行拼接、質控、去除低質量序列和嵌合體,12個樣本共獲得655100條合格16S rDNA序列,每個樣本的有效序列數目41256—77508條(表2)。細菌的有效序列長度主要分布在400—440 bp(圖1)。通過97%相似度的OTU進行稀釋性曲線分析,結果發現各個樣本曲線均趨向平坦,說明測序數據量合理,更多的數據量只會產生少量新的OTU,因此測序所得序列能夠完全展示樣品微生物群落多樣性(圖2)。

表 2 樣品序列數統計及菌群多樣性分析Tab.2 Numbers of reads and cliversity indes of different samples

2.2 細菌群落的α-多樣性分析

利用測序劃分的OTU對不同養殖模式下水體和底泥的α-多樣性分析結果如表2所示: 所有樣品的覆蓋度均在97%以上,在三種養殖模式下底泥樣本在實驗前后OTU數量變化不大,水體樣本OTU數量在養殖后期明顯增加。

Chao1和ACE指數反映群落分布豐度,指數越大,豐度越高,Shannon和Simpson指數指示群落分布多樣性,Shannon指數越大、Simpson指數越小,說明群落多樣性越高。在三種養殖模式下底泥樣本的Chao1、ACE和Shannon均高于水體樣本,說明底泥的群落豐度及多樣性明顯高于水體。養殖初期與末期樣本群落豐度比較,底泥樣本的Chao1和A C E 指數前后變化不明顯,而水體末期樣本(WAE、WBE和WCE)的Chao1和ACE指數明顯高于初期樣本,其中WBE最高,WCE最低。養殖初期與末期樣本群落多樣性比較,底泥樣本的Shannon和Simpson指數前后變化不明顯,而水體末期樣本(WAE、WBE和WCE)的Shannon指數明顯高于初期樣本,其中WCE最高,WAE最低;水體末期樣本的Simpson指數明顯低于初期樣本,其中WCE最低,WAE較高。因此,在三種養殖模式下水體中末期的群落豐度和多樣性均高于養殖初期,并且黃顙魚草魚混養組水體群落豐度最高,黃顙魚草魚鰱鳙混養組水體群落多樣性較高。

2.3 水樣與底泥樣品菌群之間的關系

基于OTU豐度的樣本聚類圖可知: 底泥和水體樣本分別聚為一簇,底泥樣本間的空間距離較短,相似性更高。水體和底泥初期樣本與末期樣本各自具有較高的相似性。三種養殖模式對比,A、B模式與C模式下的樣本表現出更大的空間距離(圖3)。

為進一步探究每個樣本中細菌多樣性的相互關系,通過維恩分析觀察水體和底泥樣本OTU數目組成相似性及重疊情況。

對水體初期和末期各樣本中只有一條序列的OTU進行統計分析,發現其數量已經達到總有效OTU數量的60%以上,表明各樣本細菌種類多但大多數細菌豐度較小。養殖初期各水樣共有OTU數為151條(圖4a),占三者OTU總數的8.36%,養殖末期各水樣共有OTU數為476條(圖4b),占三者OTU總數的14.88%,表明隨著養殖活動的進行,水體樣本間細菌群落相似度有所增加。

從底泥樣本的菌群相似性來看,養殖初期各泥樣共有OTU數為1568條(圖4c),占三者OTU總數的31.17%,養殖末期各泥樣共有OTU數為1104條(圖4d),占三者OTU總數的21.64%,養殖前后底泥樣本之間共有OTU的比例均較高,說明在不同養殖時期、不同養殖模式下底泥群落相似性均比較高,但養殖后期三者共有OTU數占比下降,說明不同的養殖魚類使底泥樣本微生物群落結構逐漸分化。

PcoA分析各樣品間的差異和距離,從圖5a可以看出,6個水體樣本可以分為2個相似群落,其中初期樣本和末期樣本分別聚集在一起,而6個泥樣樣本全部聚集在一起,這與聚類分析的結果一致。對水樣進行PcoA分析發現(圖5b),沿PC1坐標方向(貢獻率為37%),初期樣本與末期樣本分別趨于收斂,沿PC2坐標方向(貢獻率為20%),初期樣本得以分開,說明黃顙魚的養殖使水體微生物群落構成相似度逐漸升高。對泥樣進行分析發現(圖5c),養殖初期各樣本在PC1(貢獻率為32%)及PC2(貢獻率為24%)方向均高度收斂,距離很近,說明初期樣本相似度較高,而末期各樣本在2個方向上都趨于分化,三種養殖模式下底泥的微生物群落構成相似度降低,這與聚類分析及維恩分析的結果一致。

圖1 樣品中有效序列長度分布Fig.1 Distribution of bacterial sequence lengths in the samples

圖2 各樣品高通量測序結果的稀釋性曲線Fig.2 The rarefaction curve basing on high-through sequencing results

圖3 基于高通量測序結果的聚類分析結果Fig.3 Clustering analysis results basing on high-through sequencing results of different samples

2.4 各樣本微生物菌群構成

高通量測序結果表明水樣和泥樣的核心微生物群明顯不同,養殖前后樣本之間也存在較大差異。所有樣本的序列分屬43個門,其中共有門有8個,分別為變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微桿菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、放線菌門(Actinobacteria)。除此之外,還檢測到廣古菌門(Euryarchaeota)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、衣原體門(Chlamydiae)、螺旋體門(Spirochaetes)、綠菌門(Chlorobi)、互養菌門(Synergistetes)等不常見的類群,在樣本中檢測量極低,這表明基于Illumina Miseq平臺的高通量測序可作為全面了解黃顙魚養殖環境微生物結構多樣性的有效研究手段。

對水體樣本在門水平的物種相對豐度(圖6a)分析發現,各樣本中豐度占比最大的是變形菌門,但其在養殖末期占比明顯下降,3種養殖模式的水體樣本分別從初期的75%、91.39%和80.17%,下降到養殖末期的39.5%、42.64%和30.14%。同樣明顯下降的還有厚壁菌門。豐度上升的有放線菌門、浮霉菌門、疣微桿菌門、綠彎菌門、酸桿菌門。其中,A模式水樣擬桿菌門豐度明顯上升(1.95%到10.98%),而B模式變化不大(2.11%到2.39%),C模式則略有下降(1.63%到0.76%)。從屬水平(圖6b)分析水樣的組成及豐度發現,養殖末期水體較養殖前期水體的細菌屬更豐富。部分水體樣本中包含了一些致病菌或條件致病菌,如弧菌屬(Vibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)等。其中,A模式下水體樣本中黃顙魚條件致病菌氣單胞菌屬(Aeromonas)在養殖末期豐度占優勢(5.81%),而其B、C模式下檢出量極少甚至未檢出。

對底泥樣本在門水平的物種組成豐度進行分析(圖6a)發現,底泥樣本相似度較高,豐度占比最大的門同樣為變形菌門,但其在養殖后期豐度均略有上升。其他豐度較高的還有厚壁菌門、綠彎菌門、浮霉菌門等。其中A、B模式酸桿菌門豐度下降,而C模式則有所上升。從屬水平分析(圖6b),三種養殖模式泥樣的假單胞桿菌屬在養殖末期豐度顯著增加。A、C模式不動桿菌屬(Acinetobacter)豐度下降,而B模式豐度升高。A、B模式的Litorilinea屬豐度有所下降,而C模式下豐度升高。

圖4 維恩圖Fig.4 Bacterial Venn diagram at distance 0.03

3 討論

本研究提取了黃顙魚不同養殖模式下養殖水體和底泥的微生物宏基因組DNA,采用Illumina Miseq高通量測序平臺分析了微生物多樣性。得到有效序列41256—77508條,可歸納為608—3686個分類操作單元。基于測序數據,評估了黃顙魚不同養殖模式下養殖水體和底泥的微生物多樣性及群落結構差異。

3.1 養殖水體及底泥微生物群落結構及多樣性分析

維恩圖分析及主坐標分析表明,隨著養殖活動的進行,不同養殖模式下的水體樣本共有OTU比例上升,水體樣本在主坐標分析圖中趨于收斂,表明水體樣本間相似性逐漸增加。底泥樣本雖然初期樣本相似度較高,但后期樣本共有OTU比例下降,樣本在主坐標分析圖中距離增大,表明樣本細菌群落分布趨于分化,這可能與黃顙魚的底棲特性相關。由于池塘底泥與水接觸層中微生物含量豐富[11],不同養殖模式造成的微生物群落分布差異性可能通過黃顙魚對底層水體及底泥的攪動而在底泥樣本中被放大,顯示出分化現象[12]。

樣本聚類分析結果表明,黃顙魚單養及黃顙魚、草魚混養模式下的水體和底泥的菌群組成及群落結構相似性較高,黃顙魚、草魚、鰱、鳙混養模式下樣本單獨形成一類,即樣本聚類按照有無鰱鳙聚在一起,表明鰱鳙對混養水體菌群組成和群落結構有更明顯的影響。這與唐永濤等[6]關于混養鰱鳙對池塘養殖水體微生物群落結構影響的結果一致。

對樣本的α-多樣性分析結果表明,不同養殖模式下的黃顙魚養殖均可顯著促進養殖水體微生物群落豐度和多樣性增加,但水體樣本相似度也有所增加。不同養殖模式末期樣本之間相比較,黃顙魚草魚混養模式下水體的群落豐度最高,引入鰱、鳙混養后水體微生物群落豐度明顯下降,這與Xia等[13]研究發現草魚混養鰱魚可以有效減輕草魚養殖對環境的影響結論一致。草魚是一種食草性魚類,主要食用自然環境中的水生植物,但有研究表明草魚更喜歡養殖池塘中的顆粒飼料[14]。草魚與黃顙魚混養,不僅會與黃顙魚爭奪飼料,其排泄的飼料殘渣、魚糞等廢物經過發酵分解,為細菌提供適宜環境,使水體微生物大量生長,進而培育出浮游生物,敗壞水質[13]。而適量的濾食性魚類鰱鳙引入養殖模式后,鰱鳙可以將水體中富余的微生物和浮游生物作為餌料,有效減輕草魚養殖對環境的影響[15]。同時,黃顙魚、草魚、鰱、鳙混養模式下的水體微生物群落多樣性最高,表明鰱鳙的引入還可以增加水體微生物群落多樣性。這與田相利等[16]發現的草魚、鰱、鯉(Cyprinus carpio,Linnaeus)混養使養殖環境中微生物的結構組成與代謝功能更加多樣化的結論一致。

圖5 PcoA分析Fig.5 PcoA analysis

3.2 養殖水體及底泥微生物門水平和屬水平差異

在本研究中,門類水平上的測序結果表明,在三種養殖模式下水體及底泥樣本中,變形菌門的物種豐度明顯高于其他微生物豐度,尤其是在養殖初期占絕對地位,這與Hugenholtz等[17]、陳香碧等[18]認為的變形菌門是自然環境中最常見菌群結論一致。同時變形菌門在很多養殖環境中也占據優勢地位[19],趙曉偉等[20]對紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes,Temminck &Schlegel)養殖水體和底泥的微生物群落分析結果表明,變形菌門為優勢菌。但隨著養殖時間的延長,各種細菌的分布逐漸均勻,變形菌門細菌優勢逐漸減弱。

放線菌門在物質代謝上具有獨特的優點,在微生物修復水體環境中也有應用[21],尤其以溶藻作用在防治赤潮方面具有重要作用[22]。在本研究中,放線菌門在養殖初期豐度不高,但到養殖末期,卻成為水體樣本中占比第二的優勢門,尤其在黃顙魚草魚混養模式下,放線菌豐度占比超過三分之一。這可能是由于魚類養殖過程中,養殖水體中的殘餌、魚糞等逐漸富集,造成浮游植物生物量變大,為放線菌的生長繁殖提供營養。

擬桿菌門是溶解性有機物的主要消費者。有研究表明,養殖環境中殘留餌料及養殖動物糞便在水體中未被及時分解并沉積在水體及底泥中時,會造成養殖池塘底部擬桿菌門細菌含量增加[23]。本研究黃顙魚單養及混養草魚時,養殖末期水體及底泥擬桿菌門細菌含量均明顯增加,這可能是因為混養草魚后餌料殘渣和魚糞沉積在水體尤其是底泥中,導致擬桿菌門細菌大量繁殖。而黃顙魚、草魚、鰱、鳙混養模式下的環境樣本中擬桿菌門細菌含量大幅下降,指示濾食性魚類鰱鳙的引入有效消耗水體中的草魚糞便及殘余餌料[13],抑制擬桿菌門細菌生長。

酸桿菌門是土壤中重要的一類微生物,是苯酚的主要降解菌[24]。有學者推測酸桿菌門的部分菌種對纖維素有一定的分解能力,而纖維素是植物細胞壁的主要組成成分[22]。在本研究中,底泥樣本中酸桿菌門占比較高,這可能是由于底泥中沉積的餌料殘渣尤其是草魚糞便中含有大量纖維素。

在本研究中,厚壁菌門也是樣本中豐度較高的優勢門,但近年來針對該門的研究主要集中在其作為主要腸道菌群與肥胖的關系上[25]。對于本研究中養殖水體厚壁菌門豐度下降的原因還有待進一步研究。

水產養殖動物細菌性疾病的爆發往往與腸道細菌生態平衡異常相關[26]。養殖魚類腸道菌群組成與養殖池塘底泥及水體微生物群落結構組成密切相關[27],尤其是淡水魚腸道內優勢菌與養殖水體優勢菌組成一般具有相似性[28]。有研究表明,魚類腸炎的病發與腸道內氣單胞菌大量繁殖相關[29]。周金敏等[26]對患細菌性出血病的黃顙魚與健康黃顙魚腸道中的氣單胞菌進行比較,發現患病黃顙魚腸道內的氣單胞菌數量大幅增加。在本研究中黃顙魚單養模式下水體樣本中氣單胞菌在養殖末期豐度占優勢,極有可能是單養模式下的黃顙魚腸道內氣單胞菌數量上升所致,該模式下黃顙魚患出血性腸炎的概率大大增加。因此,有針對性的增加一些套養魚類可以降低黃顙魚單養潛在的養殖風險。

圖6 樣品在門和屬水平物種相對豐度Fig.6 Relative abundance of species in phylum and genus level

4 結論

本研究結果顯示,不同養殖模式下的黃顙魚養殖環境微生物均體現了高多樣性和高豐度特征,這可能對池塘微生態系統穩定和致病菌的抑制起到積極調控作用。然而,在黃顙魚單養模式下水體條件致病菌數量有所上升,存在潛在致病風險;在黃顙魚草魚混養模式下,草魚排泄物造成水體中具有分解有機質功能的部分微生物豐度顯著增大,同時整體群落豐度也較高,促進浮游生物的生長(相關數據未發表),可能導致水體富營養化升高。只有在適量的濾食性魚類鰱、鳙引入養殖模式后,通過鰱、鳙的混養有效減輕黃顙魚養殖對水體及底泥菌群組成和群落結構的負面影響,同時增加水體微生物多樣性,幫助恢復水質健康。因此,從微生物群落結構和多樣性的角度考慮,黃顙魚、草魚、鰱、鳙混養是一種值得推薦的養殖模式。