幾何形態測量法結合Micro CT掃描對兩水系花斑裸鯉的形態分析

李曉慧 湯永濤 田 菲 趙 凱

(1.中國科學院西北高原生物研究所高原生物適應與進化重點實驗室,青海省動物生態基因組學重點實驗室,高原魚類進化與功能基因組學實驗室,西寧 810008;2.中國科學院大學,北京 100049;3.河南師范大學,新鄉 453007)

花斑裸鯉(Gymnocypris eckloniHerzenstein),隸屬鯉形目(Cypriniformes),鯉科(Cyprinidae),裂腹魚亞科(Schizothoracinae),主要分布在我國柴達木水系格爾木河和黃河水系上游干支流[1]。花斑裸鯉物種最早是由俄國魚類學家Herzenstein于1891年提出,他運用盡可能多的標本研究花斑裸鯉的形態性狀,指出花斑裸鯉存在兩個地理種群,主要分布于黃河水系上游及柴達木水系格爾木河,并將格爾木河的花斑裸鯉定為模式標本[2]。在隨后的近一百年里,我國魚類學家相繼對花斑裸鯉的形態和分類進行過大量研究。武云飛等[1]對兩水系花斑裸鯉的形態進行大量統計分析,結果顯示除扎陵湖與鄂陵湖種群的鰓耙數偏高,呈現湖泊種所具有的地區性差異外,其余特征,包括口裂、背鰭距尾鰭基部距離、下頜形態等在兩種群間均沒有差異。此外,陳毅峰和曹文宣[3]經過大量形態學研究也得到了類似結果,認為兩水系花斑裸鯉形態相似,是同一物種的不同地理種群。同樣,趙鐵橋[4]在對格爾木河、黃河水系上游與河西水系不同地理種群花斑裸鯉的形態學研究中提出,花斑裸鯉具有中間形態,其形態上的差異難以構成種級分化標準。以上學者基于形態學研究均認為黃河與格爾木河的花斑裸鯉是同一物種的不同地理種群。

然而,自從20世紀80年代隨著分子生物學的發展,分子水平上對兩水系裸鯉系統關系的研究卻呈現出與形態學研究完全不一致的結果。趙凱等[5]利用線粒體標記Cytb基因對黃河水系、柴達木水系格爾木河花斑裸鯉的系統發育關系進行了研究,發現兩水系花斑裸鯉經過地理隔離已經發生了獨立進化。隨后,Zhao等[6]在增加了祁連裸鯉的樣品后,發現花斑裸鯉的兩個地理種群沒有形成單系群,而顯示為相互獨立起源的并系,再次肯定了上述結果的有效性。這一研究結果對花斑裸鯉的分類學及其兩個地理種群的分類地位提出了不同的看法。

長期以來,對花斑裸鯉的形態學研究多采用傳統形態測量方法,這一方法容易受主觀因素的影響,也容易忽視一些肉眼難以觀察到的性狀[7,8],同時傳統的形態分類標準,如口裂、鰓耙等多為環境適應性特征,易受環境影響而發生改變,不能客觀反映物種的形態特征。隨著科學技術的發展,現代幾何形態測量法(Modern geometric morphometrics) 和Micro CT掃描技術(Micro computed tomography,微計算機斷層掃描技術) 被廣泛應用于物種形態鑒定。幾何形態測量法是于20世紀90年代Bookstein[9]和Rohlf[10]以數學為基礎所創,將統計學方法應用于形態分析,通過標志點(Landmark) 與滑動半標志點(Semi-landmark) 相互補充,對整體輪廓進行描繪[11],并最終通過多元統計分析對物種形態進行相似性比較和差異分析[12—14],進而定量判定形態特征的異同。經過近30年的發展,幾何形態測量法已滲透到多個領域中[15—17],且在裂腹魚類的形態鑒定中也已應用成熟[18—20]。Micro CT掃描是基于X射線對活體小動物進行斷層掃描的一項技術,是利用不同組織對X射線吸收和透過率不同的原理實現的[21]。Micro CT掃描技術因其超高的分辨率更容易發現骨骼結構上的差異,現也廣泛應用于小鼠骨密度研究、硬骨魚類脊椎研究等多種小動物的骨骼形態研究方面[22—24]。

因此,為清楚闡釋兩水系裸鯉是否因為傳統測量方法的局限性,使其分子與形態學研究不一致這一問題,本研究運用新型的幾何形態測量法并結合Micro CT掃描技術,對兩水系花斑裸鯉的頭部形態及骨骼特征進行了定量分析,這對正確評價兩水系花斑裸鯉真實的系統發育關系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用花斑裸鯉兩個地理種群的樣品分別采集于青藏高原東北部的黃河水系上游河段和柴達木水系格爾木河(圖1),共采集116個樣本(表1),同時作為本次實驗對照組的青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii przewalskii) 樣品均采集于青海湖水系(圖1),共19個樣本(表1)。采集時間分別為2010年、2012年和2014年。采集時使用流刺網、地籠捕撈,并保存于95%酒精中,部分保存于福爾馬林溶液中,現均存于中國科學院西北高原生物研究所高原魚類進化與功能基因組學實驗室和中國科學院西北高原生物研究所標本館內。

圖1 采樣地點示意圖Fig.1 Map of the head-water area of the Yellow River,Golmud River,and Qinghai Lake showing the sampling sites

1.2 圖片信息獲取

選取頭部側面輪廓和下頜輪廓對黃河與格爾木河花斑裸鯉(N=116) 進行形態比較。此外,補充了19個青海湖裸鯉樣本作為外類群進行對照。具體方法如下。

所有樣品均使用錫恩帝HX700數碼相機拍攝,每個樣品采集兩張照片,分別為魚頭部左側和腹部圖片,拍攝時用鑷子或大頭針固定魚的形態使其保持自然狀態[19]。為減少系統誤差,使用翻拍架固定相機位置,布置藍色背景布,放置刻度尺,統一樣品擺放位置,以確保樣品與采集面保持平行,與相機高度距離相等。為減少拍攝時的人為誤差與偶然誤差,所有拍攝均由一人完成。

表 1 樣品的采集水系、地點及數量Tab.1 Populations,numbers,river systems and sampling locations used in this study

1.3 標志點與半標志點選取

標志點需選取既有同源性又能準確反映物種形態信息的位點,根據類似的研究[19,20],并結合花斑裸鯉實際形態特點,本次實驗選取了花斑裸鯉頭部側面5個標志點: ①頭骨背緣末端,②吻上唇頂點,③吻下唇頂點,④口裂末端,⑤腹中線上腮蓋條膜后緣。為使其能更加精確地描繪頭部輪廓,結合文獻采用滑動技術的方法選取了17個半標志點。半標志點的確定是在IMP軟件包MakeFan8 (canisius.edu/～sheets/IMP%208.htm) 軟件中實現的,首先確定同源性位點,然后以兩者之間的連線做11條距離相等的垂線,其垂線與頭部輪廓的交點即為半標志點(圖2a)。花斑裸鯉下頜輪廓選取了2個標志點:①下頜骨上端,②下頜骨下端。下頜骨輪廓半標志點的確定同樣在MakeFan8中實現,以確定的兩個標志點作連線為直徑畫半圓,再以一組射線將其分成11份,則射線與下頜輪廓的交點即為半標志點(圖2b)。隨后利用TpsDig 2.04軟件記錄標志點與半標志點。

圖2 花斑裸鯉標志點、半標志點的選取Fig.2 Landmarks and semi-landmarks of G. eckloni

1.4 圖像數字化處理與統計分析

采用TPS系列軟件對圖片進行數字化處理[25]。利用TpsUtil (tpsutil.updatestar.com) 修改樣本的ID,把本研究所涉及到的照片數據“矢量化”,最終生成擴展名為“.NTS”的二維坐標矩陣文件,用tpsDig 2.17 (life.bio.sunysb.edu/morph) 統一所有照片的比例尺以及按上述標志點對樣本頭部側面和下頜進行標定。隨后將生成的“.NTS”文件導入MorphoJ[26](flywings.org.uk/MorphoJ_page.htm) 軟件中,進行New Procrustes fit消除非形變因素對數據分析的影響,即對樣本進行普氏印疊(Generalized Procrustes Analysis,GPA)。GPA實際上是對數據標準化的過程,即通過對每個樣品的標志點進行平移、縮放、旋轉的過程來消除非形狀因素產生的誤差,使樣本的幾何形態得到精準的客觀復原[9—13]。然后運用MorphoJ對普氏坐標數據進行主成分分析(Principal components analysis,PCA),用以分析不同水系花斑裸鯉幾何形態上的差異;之后將二維坐標數據導入到PAST3.0[27]中進行辨別分析(Discriminant analysis,DLA),根據其不同地理種群二維坐標的特征值判斷兩水系花斑裸鯉的種群歸屬問題;進行典型變量分析(Canonical variable analysis,CVA),討論花斑裸鯉兩個地理種群間的差異,并計算馬氏距離(Mahalanobis distance) 和普氏距離(Procrustes distance),來定量分析兩種群間的形態差異量。

1.5 Micro CT掃描

本次實驗使用QuantumGX Micro CT掃描系統,分別選取黃河水系花斑裸鯉21條,格爾木河花斑裸鯉22條進行骨骼掃描,分析兩水系花斑裸鯉在骨骼方面是否存在未被發現的細微特征。參數設置: 電壓70 kV,電流114 μA(該電流為此電壓下的最大電流),視場86 mm,X-射線滲透Cu 0.1 mm,掃描模式采用High Resolution 4min,其余保持默認參數。

2 結果

2.1 兩水系花斑裸鯉頭部形狀的主成分分析

幾何形態學分析顯示,花斑裸鯉的兩個地理種群在主成分分析上并沒有形成兩個形態組,而是聚在一起 (圖3)。頭部輪廓的前兩個PCA共解釋了85.15%的變異量,其中PC1的貢獻率為70.42%,PC2的貢獻率為14.73%。在PCA二維分布散點圖中,黃河與柴達木水系格爾木河的花斑裸鯉聚在一起,有很大程度的重疊,并沒有明顯的形態差異。沿PC1軸的正方向,兩水系花斑裸鯉最明顯的變化表現在1、2、3號特征點上,即口型位置發生了變化,逐漸表現為口亞下位的特點,符合花斑裸鯉的口型特征。

下頜輪廓的前兩個PCA共解釋了87.9%的變異量,其中PC1的貢獻率為80.98%,PC2的貢獻率為6.92%。在下頜輪廓的PCA散點圖中,兩水系花斑裸鯉與青海湖裸鯉都有一定程度的重疊,彼此之間均沒有明顯差異。下頜形態的網格圖同樣顯示兩水系花斑裸鯉在下頜形態上沒有差異,均表現為吻鈍圓,下頜弧形。

圖3 黃河與格爾木河水系花斑裸鯉頭部側面輪廓(a) 與下頜輪廓(b) 的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the head profile (a) and mandibular profile (b) of the G. eckloni in Yellow River and Golmud River

圖4 花斑裸鯉頭部側面輪廓的判別分析Fig.4 The scatter diagram based on the LDA for the cephalic side contour of the G. eckloni

圖5 花斑裸鯉下頜骨輪廓的判別分析Fig.5 The mandible morphological variations of the G. eckloni based on LDA

2.2 兩水系花斑裸鯉頭部形態的判別分析

除通過PCA分析計算研究樣本幾何形態上的差異外,本研究采用判別分析探討兩水系花斑裸鯉在形態上是否屬于同一類別(圖4和圖5),結果顯示: 在側面輪廓的判別分析中,Axis1和Axis2分別占總體變異的55.5%和44.5%,判別分析的結果顯示黃河水系與柴達木水系格爾木河的花斑裸鯉在側面輪廓有很大程度的重疊,屬于同一類別,與青海湖裸鯉存在明顯差異(圖4);圖5為下頜骨形態的判別分析結果,其中Axis1和Axis2分別代表總變異的61.24%和38.76%,花斑裸鯉2個地理種群與青海湖裸鯉之間均有不同程度的重疊,三者在下頜形態輪廓特征上均無明顯差異。判別分析結果與PCA結果基本一致。

2.3 兩水系花斑裸鯉頭部形態的典型變量分析

為量化花斑裸鯉兩個地理種群間的差異,本文對兩水系花斑裸鯉分別進行了頭部形態的典型變量分析(圖6),并計算馬氏距離與普氏距離(表2—表5)。頭部側面輪廓的典型變量分析中CV1和CV2分別代表總體變異的59.42%和40.58%,在CV1軸上兩水系花斑裸鯉沒有差異,沿CV1軸正方向表現出口亞下位的特點,與PCA分析一致。在CV2軸上兩水系花斑裸鯉有部分重疊,其差異主要表現在頭部長寬比上,沿正值方向主要表現為頭部形狀略圓一些,正值處的特征在黃河水系花斑裸鯉種群中更明顯一些。

下頜形態的典型變量分析中CV1代表總體變異量的75.74%,CV2代表總體變異量的24.26%。CV1展示的差異形態主要表現在下頜骨的形狀上,CV1正值處格爾木水系花斑裸鯉的特征比較明顯。兩水系花斑裸鯉在CV2軸上存在重疊,沒有明顯差異。

此外通過計算花斑裸鯉兩個地理種群與青海湖裸鯉頭部形態的普氏距離與馬氏距離,得到了與上述相似的結果,即三者之間沒有明顯的形態變異。特別是在頭部側面輪廓計算中相較于青海湖裸鯉,花斑裸鯉的兩個地理種群間的變異較小,無明顯形態特征。

2.4 Micro CT掃描結果

本研究分別對兩水系花斑裸鯉的骨骼進行Micro CT掃描,并補充13條青海湖裸鯉的CT掃描結果作為對照,結果顯示在背鰭支鰭骨插入椎骨間的位置上有所不同。背鰭支鰭骨插入椎骨的相對位置如表6所示: 在黃河水系花斑裸鯉中,背鰭第一支鰭骨位于11—12椎骨間,第二支鰭骨位于13—14椎骨間(圖7a)的樣本占到總研究樣本的61.9%;在格爾木河水系花斑裸鯉的研究中,背鰭第一支鰭骨位于9—10椎骨間,第二支鰭骨位于11—12椎骨間(圖7b)的樣本占到總研究樣本的59.1%;青海湖裸鯉在該特征上存在顯著區別于兩水系花斑裸鯉的形態特征,即第一支鰭骨與第二支鰭骨插入椎骨無間隔的性狀(圖7c),且占到研究樣本的61.5%。此外三者均存在背鰭第一支鰭骨位于10—11椎骨間,第二支鰭骨位于12—13椎骨間的樣品,但用卡方檢驗進行統計分析,結果顯示**P＜0.001,說明三者在背鰭支鰭骨插入椎骨間的相對位置上存在極顯著差異。

圖6 黃河與格爾木河水系花斑裸鯉頭部側面輪廓(a) 與下頜輪廓(b) 的典型變量分析Fig.6 Canonical variable analysis of the head profile (a) and mandibular profile (b) of the G. eckloni in Yellow River and Golmud River

3 討論

3.1 不同水系花斑裸鯉的形態分析

武云飛等[1]、曹文宣和陳毅峰[3]根據形態特征對黃河與柴達木水系格爾木河花斑裸鯉的形態學特征進行了研究,他們基于20多項形態分析得出了一致結論,即兩水系花斑裸鯉的形態學特征沒有差異,應屬同一物種的不同地理種群。此外,趙鐵橋在對134尾格爾木河、黃河上游水系及河西水系不同地理種群花斑裸鯉的形態學研究中發現,其下頜角質內緣、第一鰓弓鰓耙數等七項鑒別特征中均存在變異性大、性狀不穩定等特點,難以作為種級鑒別特征,其形態上的細微差異不能作為物種分類標準[4]。本文通過采用更為先進的形態測量方法,對兩水系花斑裸鯉頭部形態及骨骼特征進行精確的定量分析,得到了比之前的研究更為豐富的結果。對花斑裸鯉兩個地理種群頭部輪廓定量分析的結果顯示與上述前人的研究結果一致,即對頭部輪廓特征點做PCA分析、判別分析和典型變量分析(圖3—圖6)均沒有發現二者在頭部輪廓形態上存在差異,馬氏距離與普氏距離也同樣顯示兩水系花斑裸鯉頭部輪廓的變異量很小。然而值得關注的是,基于骨骼3D模型的比較,發現花斑裸鯉兩個地理種群在“背鰭第一支鰭骨插入椎骨位置”這一性狀上有著顯著性差異(圖7),該性狀在蝦虎魚屬中是一個重要的鑒別特征[28]。本研究是首次發現該性狀在裂腹魚類種群間存在顯著性差異,但是否可以作為裂腹魚類的一個鑒別特征還需今后廣泛取樣,在整個裂腹魚亞科上進行實驗驗證。

表 2 花斑裸鯉不同種群頭部側面輪廓的馬氏距離比較Tab.2 Comparison of Mahalanobis distance of head profile of the G. eckloni in Yellow River and Golmud River

表 3 花斑裸鯉不同種群頭部側面輪廓的普氏距離比較Tab.3 Comparison of Procrustes distance of head profile of the G. eckloni in Yellow River and Golmud River

3.2 不同水系花斑裸鯉形態演化的生態學機制

物種形態的演化深受生態壓力的影響,特別是地質地貌的改變對物種的形態分化往往起著重要作用,魚類口型下頜等環境適應性特征更是與其所處的流水環境和食物組成息息相關。高原河流生態位少,食物供給相對有限,在高原魚類中發生形態趨同的現象極為普遍,如湯永濤等[20]在對高度特化等級裂腹魚類基于簡化基因組水平的研究中就發現裸鯉屬與裸裂尻魚屬存在的大量形態趨同導致了分類學混亂。然而骨骼是構成脊椎動物的基本結構,在長期的形態演化中受環境影響較小,不僅起到支撐身體形態的作用,也是物種分類的重要依據[29]。早在20世紀90年代,孔曉瑜等[30]根據魚類的骨骼特征,頭骨、椎骨及附肢骨骼的差異將中國鱖亞科分為了三個屬。在蝦虎魚的分類鑒定中,Birdsong等[31]將“背鰭支鰭骨插入椎骨間的相對位置”作為一個重要的分類依據,對200個屬500種蝦虎魚進行了分類鑒定。

表 4 花斑裸鯉兩個地理種群下頜輪廓的馬氏距離比較Tab.4 Mahalanobis distance of mandibular contour between two geographic populations of G. eckloni

表 5 花斑裸鯉兩個地理種群下頜輪廓的普氏距離比較Tab.5 Procrustes distance comparison of mandibular contour between two geographic populations of G. eckloni

表 6 不同水系樣品背鰭支鰭骨與椎骨相對位置統計表Tab.6 The relative position of dorsal fin bone and vertebra in different drainage of sample

就本文而言,花斑裸鯉的兩個地理種群(黃河和格爾木河)基于前人在形態學上的研究應屬同一物種,但對兩者分子水平上的研究顯示他們是由不同祖先進化而來的并系。本研究所用的幾何形態測量法,與傳統測量方法相比,更能精確定量物種的形態特征,但采用幾何形態測量法,分析兩水系花斑裸鯉的環境適應性特征,頭部形態及下頜骨輪廓,仍未發現兩者存在顯著差異,幾何形態測量法支持了傳統測量結果。但通過Micro CT掃描技術對花斑裸鯉兩地理種群的骨骼結構進行分析,卻觀察到在“背鰭第一支鰭骨插入椎骨位置”這一更具分類學意義的特征上具有顯著性差異。本文認為這很可能是由于兩水系相似的生態環境造成的適應性形態趨同。青藏高原東部的黃河上游與柴達木水系的格爾木河地理相鄰,同時發源于昆侖山脈[32]。作為花斑裸鯉模式生物產地的格爾木河,河水補給主要來源于高山融雪,食物組成相對有限,硅藻類是其水體生態系統的重要組成部分[33],底棲動物僅有寡毛類和鉤蝦。黃河上游同處高海拔,河水多來源于高山冰雪融水,且食物組成中同為硅藻類占據優勢[1,34],兼有少量搖蚊幼蟲等。花斑裸鯉的兩個地理種群均為雜食性魚類,以硅藻、搖蚊幼蟲為主要食物,兩個地理種群食性結構相似,在長期自然選擇中很可能導致與食性相關的形態特征,如口裂、下頜形狀等發生了趨同進化。此外,另一值得關注的結果是花斑裸鯉兩個地理種群與青海湖裸鯉的“背鰭支鰭骨相對于椎骨位置”這一性狀,在三者的種群內部均出現了分化,且均存在“背鰭第一支鰭骨插入第10—11椎骨間,第二支鰭骨插入12—13椎骨間”性狀,這一結果又對兩水系花斑裸鯉形態上的異同做出了另一種解釋,可能暗示了三者在“背鰭支鰭骨插入椎骨相對位置”這一性狀上尚未完全分化。青海湖裸鯉與花斑裸鯉屬近緣種,且遺傳分化時間短[5],很可能在青海湖裸鯉快速成種后,其骨骼特征分化速度較慢,還處于分化階段。而花斑裸鯉一直以來被認為是廣布種,具有廣泛的形態多態性和不同水系的遺傳分化[4,6],因而在青海湖裸鯉快速成種后,兩水系花斑裸鯉在頭部保留了原來的特征,支鰭骨相對于椎骨的位置卻呈現一定的多態性。

總之,魚類的表型性狀深受環境壓力的影響,在長期自然選擇條件下,一些環境適應性特征往往會發生改變,而骨骼系統,如椎骨數、鰭條數等則受環境壓力相對很小。因而采用幾何形態測量法與Micro CT掃描技術對魚類進行分類鑒定具有十分重要的意義,它比傳統測量方法更能精確分析形態特征。近年來,現代幾何形態測量法已在裂腹魚上得到應用,但Micro CT掃描技術卻是在花斑裸鯉為代表的裂腹魚上的首次嘗試,并發現了“背鰭支鰭骨相對于椎骨位置”這一性狀在裂腹魚亞科不同種群間存在顯著差異的特性。綜上所述,本研究豐富了花斑裸鯉不同地理種群間的形態學數據,并在形態學角度為兩水系花斑裸鯉的分類地位及種群生態學提供了理論支持。但若要清楚闡釋兩水系花斑裸鯉的進化關系,真正厘清兩者形態異同的生態學機制還需結合更廣泛的分子數據,挖掘更多有意義的核基因或簡化基因組數據進行深入研究,同時“背鰭支鰭骨相對于椎骨位置”這一性狀是首次在裂腹魚類上發現,Micro CT也是首次應用在裂腹魚類的骨骼結構研究中,今后可作為一種模式在裂腹魚類上進行廣泛的實驗驗證,建立裂腹魚類特征數據庫,判斷該性狀是否可作為裂腹魚類的鑒別特征。

圖7 不同水系樣品背鰭支鰭骨與椎骨相對位置的部分展示圖Fig.7 The relative position of the dorsal fin branch bone and vertebra in different drainage of sample