高產巖藻黃素的海洋硅藻篩選及光照條件優化

侯紅焰 向威鵬 張金榮 程鵬飛 周成旭

(寧波大學食品與藥學學院,浙江省海洋生物重點實驗室,寧波大學李達三葉耀珍伉儷李本俊海洋生物醫藥研究中心,寧波 315211)

巖藻黃素(Fucoxanthin)是類胡蘿卜素中最豐富的一種化合物,它的產量占類胡蘿卜素總產量的10%以上[1]。研究表明,巖藻黃素具有高度獨特的結構,在多烯鏈中既含有環氧鍵、羥基,又含有烯丙鍵(碳碳雙鍵)和共軛羰基(碳氧雙鍵)[2,3]。這些結構賦予了巖藻黃素抗氧化[3,4]、抗炎[5,6]、抗癌[7,8]等多種生物活性。

在工業生產中,巖藻黃素主要來源于海帶(Laminaria japonica)、裙帶菜(Undaria pinnatifda)以及羊棲菜(Hizikia fusiforme)等大型藻類[9],但其中巖藻黃素含量較低。另一方面,大型海藻多在開放的自然海區養殖,受海域、季節變化以及養殖海域的水質等因素的影響[10],大型海藻來源的巖藻黃素質量和產量相對不穩定。這些特點都阻礙了大型海藻在巖藻黃素方面的生產應用[10,11]。

海洋硅藻在海洋環境中分布廣泛,是現代海洋中生物量最為豐富的微型藻類,具有極高的生物多樣性[12]。硅藻中巖藻黃素含量約占干重的0.22%—2.17%,高于大型海藻含量的4倍以上[13—15],是巖藻黃素生產的重要來源[1]。而且,硅藻具有易于培養、生長速度快、生長環境可控等優勢[16—18]。因此,硅藻在巖藻黃素的工業化清潔生產中有著巨大潛力[19],被認為是潛在的替代大型海藻的巖藻黃素生產者[20]。

類胡蘿卜素的產生一般與環境條件有關,例如受到光照強度的影響[21]。光照強度的增加會導致微藻中采光色素含量的降低[21]。臧正蓉等[22]在對三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)生產巖藻黃素的研究中發現,90 μmol/(m2·s)和紅光條件可促進三角褐指藻的生長以及提高三角褐指藻的巖藻黃素含量,90 μmol/(m2·s)和綠光條件可促進球等鞭金藻的生長以及提高巖藻黃素的含量。同時,不同地域來源的藻株,巖藻黃素含量存在差異。Wu等[23]對六株不同來源的三角褐指藻的研究中發現,來自福州海岸的三角褐指藻中巖藻黃素的產量最高。硅藻巖藻黃素是一種重要的光合色素,位于巖藻黃素-葉綠素a蛋白復合體上,作為天線色素將激發能轉運到葉綠素[24]。巖藻黃素可以將高達60%的能量轉移到葉綠素a中[24]。不同藻株、不同環境條件,均可導致色素組成含量的變化[25—27]。可見,硅藻的生長和巖藻黃素含量在不同種類、藻株之間存在很大差異,并且培養條件同樣影響其巖藻黃素產量。因此,有必要篩選優質藻株以及獲取最優培養條件以提高硅藻巖藻黃素的產量。

本研究對16株海洋硅藻的巖藻黃素產量和得率進行測定分析,以評估同種不同株或不同種的藻株巖藻黃素生產潛能。針對其中最具高生產潛力的藻株,研究光照強度和光質對藻細胞生長過程中巖藻黃素含量的影響,以及巖藻黃素與關鍵光合色素葉綠素a和β-胡蘿卜素的消長關系,為篩選巖藻黃素優質藻株及其優化生產工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種的來源

本實驗所采用的藻種均為寧波大學海洋微藻藻種庫保存硅藻,具體種屬及庫存種質編號如表1所示。

表 1 實驗用藻種種名及庫存編號Tab.1 Algal cultures and the stock codes in Microalgae Collection Center in Ningbo University (MCCNBU)

1.2 不同藻株巖藻黃素提取率和含量分析

藻株培養與生物質收集本實驗選取的16株海洋硅藻均采用f/2培養基。在逐級擴大預培養基礎上,將生長至指數期的微藻接種到5000 mL三角瓶中進行定量培養,水體總體積4000 mL,各三組平行。在溫度為(23±1)℃、光照強度50 μmol/(m2·s),光照周期為L∶D=12h∶12h的條件下培養8d,每天人工搖瓶2次。

生長至平臺期的藻液,4℃、8000×g離心20min(冷凍離心機,天美科學儀器有限公司,中國),去上清液,收集藻細胞于-80℃冰箱中保存。將樣品真空冷凍干燥48h,獲得干燥的藻粉(冷凍干燥機,Labconco,USA)。

巖藻黃素的提取為了克服丙酮或其他有機溶劑不可在食品原料生產中使用及其易制毒和易殘留等缺點,本研究利用無水乙醇作為提取溶劑。將實驗所得硅藻藻粉每份均勻稱取0.1 g,按照10 mL/g的料液比比例向收集的藻粉中加入無水乙醇充分震蕩,使藻細胞與提取液充分接觸,在25℃水溫、超聲條件下破碎細胞5min。4℃,12000×g離心10min(離心機,Eppendorf AG,Germany),獲得巖藻黃素第一次提取液,將所得提取液分裝到對應EP管中。向離心后離心管中的沉淀再次加入1 mL無水乙醇重復以上操作,得第二次提取液。

巖藻黃素檢測用巖藻黃素標準品(Sigma,USA),采用LC-MS(ACQUITY UPLC I-Class,Waters,USA;Waters XEVO-TQD,Waters,USA)方法,使用ZORBAX SB-C18色譜柱(Waters BEH Amide 1.7 μm 2.1×100 mm,Waters,USA)。液相色譜中(表2),流動相A: 5 mmol/L乙酸銨-水溶液,流動相B: 乙腈,等度洗脫A%=2%、B%=98%,流速: 0.30 mL/min,運行時間: 5min,柱溫: 30℃,進樣量: 2 μL,檢測波長: 450 nm。質譜采用ESI-正離子模式,毛細管電壓: 3.50 kV,錐孔電壓: 30.00 V,二級錐孔萃取電壓: 3.00 V,源溫度: 150℃,脫溶劑氣溫度: 400℃,氣簾氣流量: 50 L/Hr,脫溶劑氣流量: 900 L/Hr。繪制巖藻黃素的標準曲線。在實驗質量濃度范圍內,峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

1.3 光強和光質對牟氏角刺藻累積巖藻黃素的影響

本研究選取一株牟氏角刺藻(Chaetoceros muelleri,編號4,庫存編號: NMBguh003-11)進行光強和光質影響硅藻巖藻黃素含量變化的研究,同時分析兩種重要光合色素(葉綠素a和β-胡蘿卜素)含量的變化。

實驗設置將預培養至指數期的實驗微藻接種于f/2培養基中,起始密度約1.34×104cells/mL,于250 mL三角瓶中培養,藻液總體積200 mL。白色熒光燈光源(T8),設置低50 μmol/(m2·s)、中100 μmol/(m2·s)、高200 μmol/(m2·s)三個光照強度。以LED光源設置單色紅、藍光質實驗組,光照強度50 μmol/(m2·s)。全部頂部給光,光照周期為L∶D=12h∶12h。培養溫度(23±1)℃。每天人工搖瓶2次。分別在第1、第2、第4、第6、第8天取樣以血球計數板檢測藻細胞數。光強實驗組在培養第2和第6天時、單色光質實驗組在培養第4和第8天時,各實驗組取10 mL藻樣,以玻璃纖維濾膜(GF/F)過濾,避光保藏于-80℃冰箱中,用于分析三種藻色素(巖藻黃素、葉綠素a和β-胡蘿卜素)含量。

表 2 質譜中MRM參數Tab.2 MRM parameters in mass spectrometry

光合色素分析用巖藻黃素、葉綠素a和β-胡蘿卜素標準品(Sigma,USA),同上文檢測巖藻黃素含量的方法,制作標準曲線,根據標準曲線測得色素峰面積,計算得出不同色素含量。

1.4 數據分析

第一次提取和第二次提取所得巖藻黃素的提取率來評價提取方法的可行性,并以兩次提取巖藻黃素的干重含量和提取率來確定干藻粉中巖藻黃素的真實含量,根據對不同硅藻的提取率和巖藻黃素含量分析。

提取率:X(%)=(1-m2/m1)×100%;

干重含量=m1+m2;

實際含量(mg/g)=m1/X

細胞增殖速率rt=ln(Nt-N0)/t式中,X為提取率;m1為第一次提取,巖藻黃素的得率;m2為第二次提取,巖藻黃素的得率;rt為細胞增殖速率;Nt為t時間點的細胞密度;N0為起始細胞密度;t為培養時間間隔。

數據采用Origin 2019軟件進行制圖,采用SPSS 13.0單因素方差分析(One way ANOVA)執行顯著性差異分析。

2 結果

2.1 不同藻株巖藻黃素提取率和含量分析

相同條件下培養增殖并在相同時期收集的16株硅藻,其巖藻黃素的提取率和巖藻黃素的含量具有較大的差異(表3)。直鏈藻和雙尾藻(編號分別為13和14)的提取率最高,達89%以上。而一種角刺藻(編號為7)的提取率小于1%。對同種硅藻而言,不同株牟氏角刺藻(編號1—5)的提取率也存在差異,其提取率在20%—85%,分析檢測的巖藻黃素含量為1.3—2.3 mg/g,按提取率及實測黃素含量估算的實際含量在1.3—5 mg/g。巖藻黃素的含量在不同種類的硅藻,以及同種不同株之間都存在較大差異。在此實驗中我們認為提取率大于80%為有效的提取方法。綜合考慮微藻增殖速率、巖藻黃素含量以及提取率大于80%方法標準,選取牟氏角刺藻(藻株編號4),作為后續研究的藻株。

表 3 不同硅藻巖藻黃素的提取率和含量比較Tab.3 Extraction rates and content of fucoxanthin in different strains of diatom

2.2 光照對牟氏角刺藻細胞增殖和色素變化的影響

光強對藻株生長及光合色素變化的影響 牟氏角刺藻在高200 μmol/(m2·s)、中100 μmol/(m2·s)、低50 μmol/(m2·s)三種光強下平均增殖率為分別為0.082、0.067和0.068/d,無顯著性差異(P＜0.05),培養一周(第6天)后進入平臺期,其最大生物量平均

3.4×104cells/mL(圖1A)。

分別取培養初期(2d)和平臺期(6d)的藻樣,測定巖藻黃素、葉綠素a及β-胡蘿卜素三種色素的單細胞含量。如圖1B所示,比較培養初期和平臺期色素變化: 在低光照下,葉綠素a、巖藻黃素和β-胡蘿卜素的含量在培養初期和平臺期均沒有顯著差異(P＜0.05)。在高、中光強下,葉綠素a的含量在培養初期高于平臺期;β-胡蘿卜素含量在平臺期高于培養初期;巖藻黃素含量則沒有顯著差異。比較不同光強下的各色素變化,在低光強下,巖藻黃素的含量為1.2×10-2ng/cell均高于較高光強;中、高光照條件下沒有顯著差異,平均含量為8.0×10-3和7.1×10-3ng/cell。β-胡蘿卜素的含量隨著光照強度的升高而增加,高光照強度下平臺期單位細胞含量為4.0×10-4ng/cell,較起始增加111.2%。葉綠素a單細胞含量,在培養初期隨著光強增加而增加,培養平臺期不同光強下無顯著差異。

從巖藻黃素和β-胡蘿卜素分別相對于葉綠素a的比值變化來看(圖1C),兩個比值在平臺期均較培養初期顯著增加,但隨光強增強,該比值增加的幅度不同: 巖藻黃素與葉綠素a的比值隨光強增加其增幅降低,從786.7%降至184.7%。β-胡蘿卜素與葉綠素a的比值隨光強增加其增幅增加,從3.6%增加到10.4%。平臺期時,在低光照條件下巖藻黃素相對于葉綠素a的比值最高(786.7%),β-胡蘿卜素相對于葉綠素a的比值最低(3.6%)。

光質對藻株生長及光合色素變化的影響如圖2所示,在藍光下的生長相對穩定,4d增殖速率為0.049/d,平臺期維持時間長(圖2A);而在紅光條件下,培養初期增殖相對較快,4d增殖速率為0.095/d,但平臺期維持時間相對短。在相同光強下,紅光最大生物量出現在第4天,為3.3×104cells/mL,藍光最大生物量在第8天,為3.0×104cells/mL。

分析紅、藍單色光質條件下進入平臺期后的單位細胞色素含量變化結果顯示(圖2B),三種色素的含量在生長平臺期維持過程中,均出現上升的特征。在紅光條件下,巖藻黃素、葉綠素a和β-胡蘿卜素分別上升89.0%、542.8%和1686.3%;在藍光條件下,分別上升195.1%、651.5%和368.6%。巖藻黃素與葉綠素a在紅光條件下上升幅度高于藍光組,產量也高于藍光組。β-胡蘿卜素在藍光條件下上升幅度高于紅光組,產量也高于紅光組。紅光組和藍光組比較,平臺初期,紅光組的巖藻黃素較藍光組高,平臺后期兩組沒有顯著差異;藍光組的β-胡蘿卜素含量均高于紅光組。

從巖藻黃素和β-胡蘿卜素分別相對于葉綠素a的比值來看(圖2C),前者的比值在平臺維持期顯著降低,β-胡蘿卜素與葉綠素a的比值變化沒有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 不同光照強度對牟氏角刺藻的影響Fig.1 Ef fects of different illumination intensitice on Chaetoceros muelleri

3 討論

巖藻黃素是硅藻中最豐富的類胡蘿卜素之一,具有豐富的生物活性。優化巖藻黃素提取工藝是實現大規模生產的關鍵過程之一。在工業化生產中,以食用級乙醇作為提取試劑,能滿足食品安全或化妝品生產中對清潔生產的要求。在本研究中,用乙醇提取不同株硅藻的巖藻黃素,檢測結果表示不同株硅藻中巖藻黃素含量差異較大,從無法計算(一種角毛藻Chaetocerossp.)到高達5.0 mg/g(兩種角毛藻:C. debilis和C. muelleri)。實驗組中最高含量與Foo等[28]使用甲醇提取角毛藻(C. calcitrans)中的巖藻黃素含量相近[(5.3±0.03) mg/g]。在Kim等[29]的研究中,乙醇提取三角褐指藻(P. tricornutum)的巖藻黃素的提取產率最高,為15.7 mg/g。但Foo等[30]的研究表明,與其他微藻(如角毛藻C. calcitrans和球等鞭金藻I. galbana)相比,三角褐指藻中提取的巖藻黃素僅為0.07 mg/g,且檢測其總提取物的抗氧化活性最小。可見,在不同的研究中,微藻巖藻黃素含量、提取率及生物活性都可能存在顯著差異。因此,典型藻株巖藻黃素累積的生物學機制研究是生產工藝優化的基礎。

圖2 不同光質對牟氏角刺藻的影響Fig.2 Effects of different light on Chaetoceros muelleri

影響微藻生理生化的一個關鍵因子——光強作為重要的光合色素之一,巖藻黃素與藻類生長、培養條件及光合系統調節過程都密切相關,光強是關鍵調節因子之一。本研究顯示,在相對低光強條件下[50 μmol/(m2·s)],牟氏角刺藻巖藻黃素累積最高。Song等[9]發現,在長耳齒狀藻(Odontella aurita)中與較高光強[300 μmol/(m2·s)]相比,在較低的光強[100 μmol/(m2·s)]下具有較高的巖藻黃素產生。Li等[31]的研究表明,高光強抑制了湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)中巖藻黃素的積累,而低光強促進了其中巖藻黃素的產生。Guo等[32]在三個光照條件下研究小環藻(Cyclotella cryptica),結果也發現,相對低光強下巖藻黃素含量最高。巖藻黃素含量受光強影響含量相對變化的特點,與藻色素受光調節合成代謝相關。紫黃素是合成巖藻黃素的重要前提物質[33,34],在強光照射下,為了提供有效的光保護,硅藻會把紫黃素轉化為玉米黃素,通過非光化學過程(葉黃素循環)耗散多余的光能[35,36],這也就降低了巖藻黃素的產生。而在低光照下,碳骨架會轉換成3-磷酸甘油醛并轉入類胡蘿卜素,尤其是巖藻黃素中。因此,藻株培養過程中營養鹽充足且光照條件較弱的情況下巖藻黃素的富集量較高[37]。本研究結果顯示,在三種光強下,培養初期和平臺期的巖藻黃素含量并沒有顯著差異。顯然,兩個生長期的營養鹽水平是有差異的。因此,除藻株因素之外,光強是影響巖藻黃素含量變化的關鍵因子。

不同藻種或不同藻株的巖藻黃素含量受光強影響下的相對變化,還與各研究所設置的光照強度區段相關。在本研究中,最低光強[50 μmol/(m2·s)]下巖藻黃素的含量最高,但在100和200 μmol/(m2·s)的光強下,單位藻細胞的巖藻黃素含量沒有顯著差異。而Mcclure等[21]的研究顯示,在此高光強區間,三角褐指藻的巖藻黃素含量仍然是比相對較低的光照條件下含量高。Guo等[32]以黑暗條件下培養為對照組發現,小環藻在10—30 μmol/(m2·s)的光照強度促進巖藻黃素積累,而40 μmol/(m2·s)對于巖藻黃素的積累沒有有益效果。當光照強度低于50 μmol/(m2·s)[例如10—40 μmol/(m2·s)]或者高于50 μmol/(m2·s)時,硅藻中巖藻黃素含量隨光照強度的增加而降低。

在本研究中,巖藻黃素、葉綠素a以及β-胡蘿卜素在不同光強條件下的消長,反映了微藻在光能適應中的調節特征。葉綠素a與β-胡蘿卜素在本實驗的最高光照強度50 μmol/(m2·s)下含量最高。β-胡蘿卜素通常被認為是巖藻黃素生物合成的前體物質,但兩者尚未發現直接的定量相關關系。巖藻黃素和葉綠素a一起構成了硅藻重要的光合作用捕光色素,在光系統光收集復合物中進行光收集和能量傳遞[37]。微藻通過調節各色素的含量實現對光合作用有效光能的充分利用和抗逆保護。例如,硅甲藻黃素(Diadinoxanthin)和硅藻黃質(Diatoxanthin)的二氨基黃素循環是微藻的短期光保護機制[38]。兩種葉黃素的含量變化隨光強的增加而增加[32]。Erdo?an等[39]的研究發現,在氧化應激的作用下新月菱形藻(Cylindrotheca closterium)中的巖藻黃素含量增加了50%以上。因此,以培養海洋硅藻進行巖藻黃素的規模化生產,尚需對多因子綜合影響的色素調節過程進行系統研究,以獲得最優培養工藝。

影響微藻生理生化的一個關鍵因子——光質 光質是環境光照影響微藻生理生化過程的另一個關鍵因子。在本研究中,牟氏角刺藻巖藻黃素的含量在紅光條件下遠遠高于藍光。臧正蓉等[40]研究也顯示,通過紅光光照能夠使三角褐指藻細胞中的巖藻黃素產量提高。在紅光下,葉綠素a的含量也較藍光下高。巖藻黃素以吸收光合作用有效光譜中的藍光為主,在單色紅光條件下,巖藻黃素與葉綠素a含量增加,可能是微藻對能量較低的紅光波長需增大吸收強度。與本研究中光強影響不同,在單色紅光或藍光下,平臺前期和平臺后期營養鹽差異可能導致藻細胞色素的累積差異。平臺后期較平臺前期,巖藻黃素和葉綠素a的含量均顯著增加。研究結果不僅說明單色紅光利于巖藻黃素的累積,而且在該條件下,營養鹽脅迫可能提高巖藻黃素的累積。在藻細胞的培養過程中,單色藍光條件下β-胡蘿卜素富集[41,42],與β-胡蘿卜素具有光保護作用相關。

規模化生產微藻中重要色素時(如β-胡蘿卜素和蝦青素的工業生產),常常面臨的一個問題是最適細胞生長的培養條件與最適色素累積的培養條件的矛盾。因此,工業上常采用兩步法生產工藝。在第一階段,微藻在最佳條件下生長,以使生物量最大化;而在第二階段,使微藻生長受到脅迫以利于目標色素的累積。目前,以微藻為培養目標生產巖藻黃素尚未實現工業化生產。本研究顯示,規模化培養至高密度時,藻細胞間的遮光會利于巖藻黃素的累積,此為工業化生產微藻巖藻黃素的一大優勢。針對典型藻株進行培養時,以最適生長的光強進行增殖培養,以平臺期低光照或紅光脅迫,還可能進一步實現生產工藝優化。本研究關于三種關鍵光合色素的消長特征還顯示,可能葉綠素含量低的藻株更能積累巖藻黃素,并且葉綠素含量低的藻株很可能更容易高密度培養。此結果提示了微藻巖藻黃素優勢藻株的篩選和種質創制的研究目標。

4 結論

本研究對16株海洋硅藻巖藻黃素含量進行了分析,發現不同種或同種不同株的硅藻,即使在完全相同的條件下,其提取效率具有差異,從而導致對含量評價的差異。對一株提取率大于80%的牟氏角刺藻進行了光強和光質條件對重要光合色素影響的分析,證明了低光照和紅光條件是硅藻累積生產巖藻黃素的關鍵因子。本文為后續篩選素優質藻株、巖藻黃素的提取和分析以及累積生產工藝優化提供了參考。