lncRNA SNHG14通過miR-217-5p/FHIT分子軸抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲能力

魯帥奇 楊凌博 秦帥鋒 張寒 孫建濤

鄭州大學附屬洛陽中心醫院泌尿外科（河南洛陽471009）

膀胱癌是最常見的泌尿系統腫瘤，其惡性程度較高，具有易轉移、易復發的特點［1］。傳統的治療如手術治療、化療等在近十幾年有了較大的發展，然而膀胱癌患者整體的預后仍然較差［2］。基因水平的靶向治療是膀胱癌研究的重要方向。長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸的單鏈RNA 分子，由于缺少有效的開放閱讀框或包含高密度的終止子，不具有編碼蛋白質的功能，長期以來被認為是沒有生物學功能的轉錄副產物［3］。研究［4］表明，lncRNA 可在表觀遺傳調控、轉錄調控和轉錄后調控等多層次調控基因的表達。越來越多的lncRNA 被證實在膀胱癌發生、發展中具有重要調控作用，lncRNA 已成為膀胱癌研究領域新的熱點［1］。lncRNA SNHG14 是一個新發現的lncRNA。有研究［5］表明，SNHG14 在惡性神經膠質瘤組織和細胞株中的表達明顯降低，高表達SNHG14 可明顯抑制神經膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力，在神經膠質瘤中發揮抑癌基因作用。SNHG14 在膀胱癌中的表達及作用機制尚不明確。本研究旨在探究SNHG14 在膀胱癌組織和細胞株中的表達，觀察高表達SNHG14 對膀胱癌細胞增殖和侵襲能力的影響及其分子作用機制，以期為膀胱癌的基因靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床標本選取本院泌尿外科于2016年11月至2019年2月行膀胱癌根治性手術切除的癌組織和相應的癌旁組織75 例，于液氮中冷凍保存，標本均經本院兩名以上病理科專家確診。患者平均年齡（54.43±8.32）歲，術前均未行放化療。本研究經本院倫理委員會同意且患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞與主要試劑正常膀胱上皮細胞（SVHUC-1）和膀胱癌細胞株（J82、T24、5637、BIU-87）購自中國典型培養物保藏中心。DMEM/F12 培養基、RPMI 1640培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。SNHG14高表達質粒和陰性對照質粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。Transwell 小室購自美國康寧公司。轉染試劑LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen 公司。Matrigel 基質膠購自美國BD 公司。熒光實時定量PCR（qPCR）試劑盒購自天根生化科技有限公司。二抗購自武漢博士德生物有限公司。噻唑藍（methyl thiazol tetrazolium，MTT）試劑盒和二甲基亞砜購自南京凱基生物科技發展有限公司。一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司。ECL 顯影液購自美國Thermo 公司。

1.3 細胞培養和質粒轉染J82、T24、5637、BIU-87細胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，SV-HUC-1生長于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。以對數生長期的BIU-87 細胞為對象，利用LipofectamineTM3000 轉染試劑，分別轉染陰性對照質粒和SNHG14高表達質粒，定義為對照組和實驗組。轉染細胞24 h 后，更換新鮮的RPMI-1640 培養基。

1.4 RNA 提取和熒光實時定量PCR提取75 例膀胱癌組織和細胞株的總RNA，采用超微量分光光度計檢測每個樣品在260 nm 和280 nm 波長處的分光度值，將RNA（二者比值在1.8～2.0 之間）逆轉錄為cDNA。根據試劑盒說明書配制qPCR 反應體系。以U6 為內參檢測miR-217-5p 的表達，以GAPDH 為內參檢測SNHG14 和FHIT mRNA 的表達。SNHG14 上游引物為5′-CGTTGTCGAAAGCTAAAAGGA-3′，下游引物為5′-TGTTTCCATCTCACCAAATGC-3′；miR-217-5p 上游引物為5′-GGATGACGTAGTCCTTGA-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；GAPDH 上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；FHIT 上游引物為5′-ATCTCATCAAGCCCTCTGTAGT-3′，下游引物為5′-GGACGCAGGTCATGGAAGC-3′；U6 上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR參數為95 ℃預變性5 min，62 ℃25 s，72 ℃25 s，35 個循環，得到Ct 值。獲得的Ct 值采用2-ΔΔCt方法計算基因表達量。

1.5 MTT 檢測BIU-87 細胞增殖將轉染后的BIU-87 細胞胰酶消化后接種于96 孔板，37 ℃、5%CO2培養箱培養。分別于接種后的第1、2、3、4、5天，每孔加入15 μL 濃度為5 g/L 的MTT 溶液，繼續培養4 h，每孔加二甲基亞砜200 μL，振蕩15 min。以空白孔調零，酶標儀測定每組細胞在450 nm 波長處的光密度（OD）值。

1.6 Matrigel 侵襲實驗檢測BIU-87 細胞侵襲將轉染后的BIU-87 細胞胰酶消化后接種于預鋪Matrigel 膠的Transwell 上室，每組均設4 個復孔。加 入600 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培養基至Transwell 下室。繼續培養24 h 后，取出Transwell上室，采用多聚甲醛室溫下固定10 min，采用0.1%結晶紫染液室溫下染色10 min，采用棉簽輕輕擦去殘留細胞。高倍顯微鏡下拍照、計數，進入下室的細胞量代表細胞侵襲情況。

1.7 生物信息學技術預測SNHG14 作用的分子機制采用LncBase Predicted v.2 軟件預測SNHG14可互補結合的miRNA，采用miRTarBase 軟件預測miRNA 可互補結合的基因。

1.8 Western Blot實驗檢測FHIT蛋白的表達量將轉染后的BIU-87 細胞胰酶消化、離心收集后，采用細胞裂解液提取總蛋白。檢測蛋白濃度后根據其濃度調節上樣量，于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法轉移到NC 膜。將膜置于5%脫脂牛奶封閉，進一步置于一抗FHIT（1∶1 500稀釋）、PI3K（1∶1 000 稀釋）、AKT（1∶1 500 稀釋）、p-AKT（1∶2 000）、mTOR（1∶2 000）及α-Tubulin（1∶500）在4 ℃下孵育過夜。洗膜后在二抗中孵育2 h。滴加ECL 顯影液顯影，α-Tubulin 為內參。

1.9 統計學方法應用SPSS 18.0 統計軟件進行分析，計量數據均采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗進行分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG14 在膀胱癌組織和細胞株中低表達qRT-PCR 檢測結果顯示，SNHG14 在75 例膀胱癌組織中的表達量與癌旁組織相比明顯下降［（1.16±0.32）vs.（5.07±0.77），P=0.003］，見圖1；與正常膀胱上皮細胞相比，SNHG14在膀胱癌細胞株（J82、T24、5637、BIU-87）中的表達量明顯下降（均P＜0.001），其中在BIU-87 細胞中表達最低，見圖2。

圖1 SNHG14 在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達量Fig.1 Expression level of SNHG14 in bladder cancer and adjacent tissues

2.2 轉染SNHG14 表達質粒促進BIU-87 細胞中SNHG14 表達轉染SNHG14 表達質粒后48 h，qRT-PCR 檢測結果顯示，實驗組BIU-87 細胞中SNHG14 表達量與對照組相比明顯增加［（12.65±1.46）vs.（1.00±0.05），P＜0.001］。

2.3 高表達SNHG14 抑制BIU-87 細胞的增殖MTT檢測結果顯示，在第3、4、5天，高表達SNHG14的實驗組BIU-87細胞OD值明顯低于對照組（P=0.040、0.023、0.010），表明高表達SNHG14 可抑制BIU-87細胞的增殖能力。見圖3。

圖2 SNHG14 在膀胱癌細胞株和正常膀胱上皮細胞中的表達量Fig.2 Expression level of SNHG14 in bladder cancer cell lines and normal bladder epithelial cell

圖3 高表達SNHG14 對BIU-87 細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of over expression SNHG14 on the proliferation of BIU-87 cells

2.4 高表達SNHG14 明顯抑制BIU-87 細胞的侵襲Matrigel侵襲實驗結果顯示，實驗組BIU-87細胞穿過底膜的細胞數明顯低于對照組［（85.03±10.41）vs.（26.37±7.69），P=0.004］，表明高表達SNHG14可抑制BIU-87 細胞的侵襲能力，見圖4。

2.5 生物信息學軟件預測SNHG14 作用的分子機制采用LncBase Predicted v.2 軟件預測顯示，SNHG14 可互補結合miR-217-5p；miRTarBase 軟件預測顯示，miR-217-5p 可互補結合FHIT mRNA，見圖5。

2.6 高表達SNHG14對BIU-87細胞中miR-217-5p和FHIT mRNA 表達的影響qRT-PCR 檢測結果顯示，實驗組BIU-87細胞中miR-217-5p mRNA表達量明顯低于對照組［（0.19±0.02）vs.（1.01±0.07），P＜0.001］，FHIT mRNA 表達量明顯高于對照組［（5.71±0.64）vs.（1.00±0.03），P＜0.001］，表明高表達SNHG14 可下調miR-217-5p 的表達，促進FHIT mRNA 的表達。

圖4 高表達SNHG14 對BIU-87 細胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of overexpression SNHG14 on the invasion of BIU-87 cells

圖5 生物信息學技術預測SNHG14 作用機制Fig.5 Bioinformatics technology predicts the mechanism of action of SNHG14

2.7 高表達SNHG14 對FHIT 蛋白表達的影響Western Blot 檢測結果顯示，高表達SNHG14 后，FHIT 蛋白表達量增加，PI3K/AKT 信號通路蛋白如PI3K、p-AKT 及mTOR 蛋白表達降低，提示PI3K/AKT 信號通路被抑制，見圖6。

3 討論

隨著新一代測序技術的發展，lncRNA 已成為近年來非編碼RNA 研究領域的熱點［6］。lncRNA可通過多種方式調控基因的表達，廣泛參與原癌基因或抑癌基因的上調或下調，在細胞分化、增殖、代謝、凋亡、衰老等各種生理病理活動中均具有非常重要的調控功能［7］。lncRNA 在惡性腫瘤中的差異表達和分子作用機制研究逐漸深入，越來越多的lncRNA 被發現與腫瘤的發生、發展密切相關［8］。已有一些lncRNA如ITGB1、UCA1、DUXAP10被證實在膀胱癌中發揮作用，可明顯影響膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲、耐藥性等惡性生物學行為，且與膀胱癌的早期診斷、復發、轉移和預后判斷具有相關性［9-11］。SNHG14 是一個新發現的具有抑癌基因功能的lncRNA，可通過調控miRNA 的表達，抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力。本研究結果顯示，SNHG14 在膀胱癌組織和細胞株中表達量均明顯降低，表明SNHG14 可能在膀胱癌的發生、發展中發揮抑癌作用［5］。本研究進一步通過MTT法和Matrigel 侵襲實驗發現，高表達SNHG14 可明顯抑制膀胱癌細胞增殖和侵襲能力。

圖6 高表達SNHG14 對BIU-87 細胞FHIT 相關蛋白表達的影響Fig.6 Effect of high-expressed SNHG14 on the expression of FHIT protein and related proteins in BIU-87 cells

lncRNA 在腫瘤中作用機制之一是“分子海綿”作用，即通過競爭性結合miRNA 并下調miRNA 的表達，干擾miRNA 對其靶基因的抑制作用［12］。生物信息技術預測顯示，SNHG14 可互補結合miR-217-5p，miR-217-5p 可互補結合脆性組氨酸三聯體（fragile histidine teiad，FHIT）。miR-217-5p在皮膚鱗狀細胞癌和膠質母細胞瘤組織中明顯高表達，正向調控腫瘤的發生、發展，促進腫瘤細胞的生長和轉移，發揮明顯的原癌基因作用［13-14］。本研究結果顯示，高表達SNHG14 后，膀胱癌細胞中miR-217-5p 的表達明顯降低，SNHG14 可能通過“分子海綿”作用下調miR-217-5p 的表達。FHIT 基因位于染色體3q14.2，由147 個氨基酸殘基組成，是近年來新發現的抑癌基因。FHIT 在胃癌、胰腺癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤中的表達明顯降低，FHIT 通過抑制PI3K/AKT 信號通路轉導，可顯著抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，其表達水平與腫瘤患者的預后明顯相關［15-18］。FHIT 在膀胱癌組織和細胞株中呈低表達，且FHIT 表達水平與膀胱癌的轉移、分期、分級相關，FHIT 的表達水平越高，患者生存期越長［19］。本研究結果顯示，SNHG14 抑制miR-217-5p 的表達后，FHIT 基因的表達明顯增加，表明SNHG14 可能通過靶向抑制miR-217-5p 的表達，促進FHIT 基因的表達。本研究進一步發現，BIU-87 細胞中FHIT 蛋白表達升高后，PI3K/AKT 信號轉導通路蛋白PI3K、p-AKT 及mTOR 表達明顯降低，提示PI3K/AKT 信號轉導通路被抑制。

綜上所述，本研究顯示SNHG14在膀胱癌中表達明顯降低，高表達SNHG14 可降低膀胱癌細胞的增殖和侵襲能力，其分子機制可能是抑制miR-217-5p 的表達后促進FHIT 基因的表達，從而進一步阻滯PI3K/AKT 信號通路。SNHG14 可能為膀胱癌的分子治療提供新的靶點。