自噬相關基因LC3和ATG5在胃癌中的表達及臨床意義

許祥云 陳書昌 孔德九 侯欣欣 陳強 陳靜

河南科技大學臨床醫學院，河南科技大學第一附屬醫院（河南洛陽471003）

胃癌嚴重威脅人類健康，是全球最常見的惡性腫瘤之一。根據GLOBOCAN 的最新統計數據顯示，2018年全球胃癌新發病例約103.3 萬例，死亡病例約78.3 萬例，分別位于惡性腫瘤死亡率第5 位、死亡率第2 位，位居消化系統惡性腫瘤的第1位［1-2］。由于胃癌早期無明顯臨床癥狀，大部分患者就診時病情已發展到中晚期階段，預后極差［3］。因此對胃癌診斷和治療的研究已成為目前醫學工作的重點［4］。

自噬是一個高度保守的有多個步驟參與的代謝過程，通過降解已受損的蛋白質、細胞代謝產物和病變的細胞器來維持細胞內環境的穩態［5］。近期有研究發現胃癌的發生發展與自噬活性的改變有關，且自噬相關基因微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和自噬相關基因-5（autophagy related gene-5，ATG5）均是參與自噬活性調控的重要基因。LC3 是哺乳動物中與酵母菌ATG8 同源的基因［6］，其編碼的蛋白是在高等真核細胞中發現的第1 種自噬體膜蛋白，可作為自噬標志性分子監測自噬活動［7］。而ATG5位于人類6號染色體長臂上，包含384個核苷酸多態性位點（single nucleotide PolymorPhism，SNP），編碼276 個氨基酸，是自噬過程中一種重要的ATG 基因［8］，在自噬體形成的早期階段，由ATGl2-ATG5-ATGl6L 形成的ATG5 復合物與自噬體外膜結合，促進了自噬體的伸展擴張［9］，另外還促進了LC3 向自噬體的募集。當雙層膜結構的自噬體即將形成環狀閉合結構時，ATG5 復合物便從膜上脫離下來［10］，只留下LC3-II 錨定在自噬體膜上，因此，LC3-II 含量與自噬體數量呈正比。由此可知，ATG5 促進自噬體形成，而LC3 是自噬體形成的標志。

CORREA 等［11］提出的“正常胃黏膜→LGIN→HGIN→胃癌”公認的腸型胃癌發生模式，在該途徑中自噬所扮演的角色及意義也引起廣泛的關注［12］。然而從正常胃黏膜→不典型增生→胃癌組織中，自噬基因LC3 和ATG5 在其中扮演角色尚未明確。本研究采用實時熒光定量（quantitative realtime Polymerase chain reaction，qRT-PCR）、免疫蛋白印跡（Western Blot）和免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）從核酸和蛋白兩個水平上首次驗證LC3 和ATG5 在胃癌發生不同階段的表達情況，并通過Pearson 相關分析首次分析LC3 與ATG5蛋白在胃癌發生不同階段的相關關系，為進一步了解胃癌的發生、進展與自噬活性改變之間的關系提供相關依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料經河南科技大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，收集2017-2019年河南科技大學第一附屬醫院胃鏡室及手術室病理確診的胃新鮮組織共58 例，其中男42 例，女16例，平均年齡為（62.5±12.5）歲。病理提示胃黏膜正常組17 例，不典型增生組19 例，胃癌組22 例，所有標本剪取后即刻一分為二，一半放入10%甲醛溶液中固定；另一半立即放入液氮中，隨后轉存-80 ℃冰箱備用。胃癌病理分型參照WHO 分型標準，不典型增生診斷參照維也納分型標準［13］，由兩位高年資病理醫師重新閱片診斷。所有病例均為首次發現，且經組織病理學明確診斷，患者術前未行任何放、化療，臨床資料完整，并簽署知情同意書。

1.2 試驗試劑qRT-PCR 主要試劑：反轉錄試劑盒（Aidlab 公司）；PCR 引物（上海捷瑞）。Western Blot 主要試劑：BCA 蛋白定量試劑盒（康為世紀）；30%聚丙烯酰胺（索萊寶）；PVDF 膜（密理博）。免疫組化主要試劑：LC3 兔單克隆抗體（Abcam 公司：ab222776）和ATG5 兔單克隆抗體（Abcam 公司：ab108327）；兔/鼠通用型SP 試劑盒（DAB）試劑盒（康為世紀）。

1.3 試驗方法

1.3.1 qRT-PCR（1）組織RNA 的提取：每份凍存標本取1 mm3剪碎研磨，加入1 mL Trizol（總RNA提取試劑）溶液裂解后經氯仿等提取細胞總RNA，以DNA/RNA 測定儀測定RNA 的純度和濃度，調整mRNA 的濃度在1.8～2.0。（2）cDNA 的合成按反錄試劑盒說明合成。（3）PCR 反應LC3 和ATG5 引物序列：5′-TGGATTGGTCGTGTTCATCGT-3′（上游引物），5′-CGGCTGTGTAGTCAGGGTAAG-3′（下游引物），ATG5 引物序列：5′-CAGACAACGACTGAAAGACCT-3′（上游引物），5′-CAGGATCAATAGCAGAAGGACAA- 3′（下游引物），以GAPDH 作為內參照。Q-PCR 擴增。設定合適的熒光強度閾值，將每孔樣品對應的Ct 值導入Bio-Rad 公司開發的Gene ExPression Analysis 軟件，各樣本的目的基因擴增量與GAPDH 基因擴增量的比較采用2-ΔΔCt法進行。

1.3.2 Western Blot稱取正常胃黏膜組織、不典型增生胃黏膜組織、胃癌組織約100 mg 剪碎，在液氮中充分研磨，加入約100 μL RIPA 蛋白裂解液；4 ℃下12 000 r/min 離心30 min 后取上清，測定蛋白濃度。配制10%的濃縮膠和12%的分離膠，每泳道加總蛋白量20 μg 進行電泳分離；在穩流狀態下低溫將蛋白轉至PVDF 膜，在含5%脫脂奶粉的TBST 溶液中常溫封閉1.5 h。分別加入兔抗人LC3 及ATG5 單克隆抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。10 min×3 次TBST 洗膜后加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h。10 min×3次TBST 洗膜后ECL 進行顯影、定影，GAPDH 作為內參。采用Image J 圖像分析軟件，分別用LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和ATG5 與GAPDH 灰度比值，表示LC3 和ATG5 蛋白相對表達量。

1.3.3 免疫組化各組胃組織石蠟標本切片，脫蠟，水化，高壓熱修復抗原，3%過氧化氫氧化15 min；滴加LC3、ATG5 一抗（工作液濃度均為1∶100），4 ℃過夜；滴加通用型二抗，37 ℃孵育30 min；DAB 色，LC3 顯色時間為3 min，ATG5 顯色時間為5～10 min；蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，返藍，脫水透明，封片［12］。LC3 用已知結直腸癌的陽性切片作為陽性對照，ATG5 用肝癌切片作為陽性對照，均用PBS 代替一抗作為陰性對照。根據組織切片著色的陽性細胞數和著色面積進行評分，隨機挑選5 個高倍鏡視野觀察（400 ×），采用二級計分法進行結果判斷：染色強度評分標準為：未著色，陰性，0 分；著色呈淺黃色，弱陽性，1 分；著色呈黃色或深黃色，中度陽性，2 分；著色較強呈黃褐色，強陽性，3 分；染色面積評分標準為：0 分：無陽性細胞；1 分：陽性細胞計數＜25%；2 分：陽性細胞計數占26%～50%；3 分：陽性細胞計數占＞50%。免疫組化著色評分=染色強度評分×染色面積評分，0 分記為“-”，表示陰性；1～2 分記為“+”，表示弱陽性；3～4 分記為“++”，表示中陽性；≥5 分記為“+++”，表示強陽性。為方便統計，將“-”、“+”定為陰性，“++”和“+++”定為陽性［14］。

1.4 統計學方法應用SPSS 23.0 軟件包進行統計學分析：劑量資料經正態性檢驗后服從正態分布。（1）LC3 和ATG5mRNA 表達的計量資料用（）表示，數據采用方差齊性檢驗后，應用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗法；（2）LC3 和ATG5蛋白定量表達結果用（）表示，數據采用方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗法；（3）LC3 和ATG5 蛋白陽性表達率，二者與胃癌患者臨床病理特征的相關分析，采用χ2檢驗和Fisher 精確檢驗分析；（4）LC3 和ATG5 蛋白的相關性分析采用Pearson 相關法；（5）檢驗水準：α=0.05。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR 結果通過qRT-PCR 法檢測LC3 mRNA 在不同胃組織中的表達情況，利用2-ΔΔCt法測得正常組中LC3 mRNA表達量為（35.85±27.12），不典型組中LC3 mRNA 表達量為（118.20±15.07），胃癌組中LC3 mRNA 表達量為（165.68±23.88），3 組間差異有統計學意義（F=25.34，P＜0.05）；不典型組中LC3 mRNA 表達量顯著高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；胃癌組中LC3 mRNA 表達量顯著高于不典型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

ATG5 mRNA 在不同胃組織中的表達情況：正常組中ATG5 mRNA 表達量為（2.41±1.45），不典型組中ATG5 mRNA 表達量為（8.61±0.49），胃癌組中ATG5 mRNA 表達量為（10.44±0.53），3 組間差異具有統計學意義（F=60.85，P＜0.05）。不典型組中ATG5 mRNA 表達量顯著高于正常組（P＜0.05），胃癌組中ATG5 mRNA 表達量顯著高于不典型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 LC3mRNA 在不同胃組織中的相對表達量Tab.1 Relative expression of LC3 mRNA in different gastric tissues ±s

表1 LC3mRNA 在不同胃組織中的相對表達量Tab.1 Relative expression of LC3 mRNA in different gastric tissues ±s

注：正常組與不典型組比較，*P＜0.05；正常組與胃癌組比較，#P＜0.05；不典型組與胃癌組比較，&P＜0.05

分組正常組不典型組胃癌組例數17 19 22 LC3 mRNA 35.85±27.12 118.20±15.07*165.68±23.88# &F 值25.34 P 值0.01

表2 ATG5mRNA 在不同胃組織中的相對表達量Tab.2 Relative expression of ATG5 mRNA in different gastric tissues ±s

表2 ATG5mRNA 在不同胃組織中的相對表達量Tab.2 Relative expression of ATG5 mRNA in different gastric tissues ±s

注：正常組與不典型組比較，*P＜0.05；正常組與胃癌組比較，#P＜0.05；不典型組與胃癌組比較，&P＜0.05

分組正常組不典型組胃癌組例數17 19 22 ATG5mRNA 2.41±1.45 8.61±0.49*10.44±0.53#&F 值60.85 P 值0.01

2.2 Western Blot 結果利用Western blot 法在蛋白水平上，定量檢測LC3 和ATG5 在不同胃組織中表達情況，以GAPDH 蛋白作為內參進行對照結果示：LC3-Ⅰ分子量為16 kDa，LC3-Ⅱ分子量為14 kDa，ATG5 蛋白分子量為32 kDa，GAPDH 蛋白的分子量約為37 kDa，利用Image J 軟件對試驗結果進行定量分析。見圖1。

正常組中LC3 的蛋白表達量為（14.78±5.43），不典型組中LC3 的蛋白表達量為（25.89±6.77），胃癌組中LC3 的蛋白表達量為（34.33±12.10），3 組間差異具有統計學意義（F=11.71，P＜0.05），不典型組對比正常組LC3 蛋白表達量有顯著提高，差異具有統計學意義（P＜0.05），胃癌組中LC3蛋白表達量較不典型組有顯著提高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。正常組中ATG5 的蛋白表達量為（0.79±0.32），不典型組中ATG5 的蛋白表達量為（1.35±0.41），胃癌組中ATG5 的蛋白表達量為（2.00±0.75），3 組間比較差異具有統計學意義（F=11.94，P＜0.05），不典型組中ATG5 蛋白表達量較正常組有顯著提高，差異具有統計學意義（P＜0.05），胃癌組中ATG5 蛋白表達量較不典型組有顯著提高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

圖1 Western Blot 法在蛋白水平上檢測LC3 和ATG5 在不同胃組織中表達情況Fig.1 Western Blot method to detect the expression of LC3 and ATG5 in different gastric tissues at protein level

LC3 和ATG5 蛋白表達水平在正常組、不典型組及胃癌組中均呈正相關（r=0.89、0.80、0.72，P＜0.05）。見表3。

2.3 免疫組化結果運用免疫組織化學法在蛋白水平上，定性檢測LC3 和ATG5 蛋白在不同胃組織中表達情況，鏡下可見LC3 和ATG5 的陽性表達，陽性定位主要存在于細胞胞質中，成棕黃色顆粒狀染色。部分胞核也可見少許淺黃色陽性著色。胃黏膜正常組織表達以弱陽性為主，不典型增生和胃癌組織中表達則以強陽性為主。見圖2、3。

LC3 在58 例不同胃組織中，正常組中有3 例陽性表達，陽性表達率為17.6%；不典型組中有10 例陽性表達，陽性表達率為52.6%，不典型組中明顯高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；胃癌組中有18 例陽性表達，陽性表達率為81.8%，胃癌組中明顯高于不典型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表3 Western Blot 檢測不同胃組織中LC3 和ATG5 蛋白表達和相關性分析Tab.3 Western Blot method to detect LC3 and ATG5 protein expression in different gastric tissues and correlation analysis ±s

表3 Western Blot 檢測不同胃組織中LC3 和ATG5 蛋白表達和相關性分析Tab.3 Western Blot method to detect LC3 and ATG5 protein expression in different gastric tissues and correlation analysis ±s

注：正常組與不典型組比較，*P＜0.05；不典型組與胃癌組比較，#P＜0.05；正常組與不典型組比較，★P＜0.05；不典型組與胃癌組比較，&P＜0.05

分組正常組不典型組胃癌組例數17 19 22 LC3 蛋白14.78±5.43 25.89±6.77*34.33±12.10#ATG5 蛋白0.79±0.32 1.35±0.41★2.00±0.75&r 值0.89 0.80 0.72 P 值0.01 0.01 0.03

圖2 免疫組化法檢測不同胃組織中LC3 蛋白表達Fig.2 Immunohistochemical to detect the expression of LC3 proteinin different gastric tissues

圖3 免疫組化法檢測不同胃組織中ATG5 蛋白表達Fig.3 Immunohistochemical to detect the expression of ATG5 protein in different gastric tissues

表4 LC3 在不同胃組織中的蛋白表達情況Tab.4 Expression of LC3 protein in different gastric tissues

ATG5 在不同胃組織中蛋白表達，正常組中有1 例陽性表達，陽性表達率為5.9%；不典型組中有7 例陽性表達，陽性表達率為36.8%，由Fisher 確切檢驗法得知：不典型組中明顯高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；胃癌組中有15 例陽性表達，陽性表達率為68.2%，胃癌組陽性表達率高于不典型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 ATG5 在不同胃組織中的蛋白表達情況Tab.5 Expression of ATG5 protein in different gastric tissues

2.4 LC3 和ATG5 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的相關性LC3 蛋白表達情況與性別（P＞0.05）、年齡（P＞0.05）、浸潤深度（P＞0.05）、分化程度（P＞0.05）及淋巴結狀態（P＞0.05）均無相關性。ATG5 蛋白表達情況與浸潤深度（P＜0.05）、分化程度（P＜0.05）及淋巴結狀態（P＜0.05）存在顯著相關性。見表6。

表6 LC3 和ATG5 蛋白表達與胃癌組織臨床病理特征Tab.6 Expression of LC3 and ATG5 proteins and clinicopathological characteristics of gastric cancer

3 討論

自噬是細胞依靠自身溶酶體來清除細胞內代謝廢物或受損細胞器、長壽命蛋白質以及入侵微生物的一種維持細胞基本生命活動的過程［15］。從酵母菌到人類，這一過程均高度保守，是維持細胞動態平衡的方式之一。自噬在“正常胃黏膜→LGIN→HGIN→胃癌”公認的腸型胃癌發生模式中所扮演的角色引起了廣泛的關注，然而自噬基因LC3 和ATG5 在其中所扮演的角色尚未研究。因此本研究采用qRT-PCR、Western Blot、免疫組織化學法首次從核酸和蛋白兩個水平上驗證LC3 和ATG5 在腸型胃癌發生模式中的表達情況。試驗結果證明：在核酸和蛋白水平上結果一致，相互印證。在不同胃組織中，LC3 和ATG5 的表達也不相同，從正常胃黏膜→不典型增生→胃癌組織，LC3和ATG5 mRNA 和蛋白表達均逐漸上升，并差異具有統計學意義，提示自噬參與并促進胃癌的發生發展過程，為進一步了解胃癌的發生發展與自噬活性改變之間的關系提供相關依據。

自噬基因LC3 是哺乳動物細胞中與ATG8 同源的基因，定位于前自噬泡和自噬體膜的表面，參與自噬體的形成，其含量多少與自噬體的數量呈正比，通過檢測LC3 的含量可反映自噬活性［16］。其有Ⅰ型與Ⅱ型兩種存在形式，當自噬發生時，LC3-Ⅰ經泛素樣加工修飾過程生成其蛋白水解衍生物LC3-Ⅱ（分子量分別為16 kDa 和14 kDa）。LC3-Ⅰ被定位于細胞質，而LC3-Ⅱ結合于自噬體膜表面［17］，因此LC3-Ⅱ能更直觀的反映自噬體形成的多少，從而反映自噬活性。LIAO 等［18］的研究表明LC3 的陽性表達與Ⅰ-Ⅲ期胃癌患者術后的復發風險呈正相關，與Ⅳ期胃癌患者的生存呈負相關，提示LC3 可作為胃癌預后監測指標之一。李良慶等［19］通過免疫組化對96 例石蠟標本進行研究顯示，LC3 在胃癌中的表達明顯高于癌旁，提示自噬參與胃癌的發生。胡云峰等［20］應用免疫組化法分析120 例胃癌組織和配對正常的胃組織，結果顯示：胃癌組織中LC3 的蛋白表達量明顯高于正常組織，且LC3 高表達的患者無疾病進展生存時間更短，提示胃癌組織中有自噬發生，且LC3 的高表達是胃癌的不良預后因素。而目前通過觀察正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜、胃癌中自噬變化規律的較為鮮見，本研究通過檢測LC3 在胃癌演變不同階段的mRNA 和蛋白表達，更加直觀的反應了自噬與胃癌發生發展的關系，從正常組→不典型組→胃癌組，LC3 的mRNA 和蛋白水平逐步增高，且LC3 是自噬形成的標志性基因，得知自噬參與并促進胃癌的發生發展，但LC3 和性別、年齡、浸潤深度、分化程度、淋巴結狀態均無相關性，可能與LC3 表達量較高而樣本量較小有關。既往有一些大樣本量的研究，如王晨宇等［21］采用免疫組化對60 例胃癌和40 例癌旁組織進行分析顯示，LC3 蛋白與胃癌組織的腫瘤大小、分化程度及TNM 分期相關；黃俊玲等［22］的研究顯示LC3 蛋白表達與120 例胃癌患者的腫瘤分化程度和淋巴結轉移密切相關。

ATG5 在自噬體膜形成的早期階段，參與自噬體的形成。宋兆孟等［23］的研究表明在酵母和哺乳動物中去除ATG5 能阻滯自噬，因此，ATG5 在自噬中起重要作用［23-24］。王婷等［25］表明ATG5 在卵巢癌中表達與良性卵巢腫瘤及交界性卵巢腫瘤相比明顯升高，下調ATG5 表達水平后卵巢癌增殖能力明顯受到抑制。另外，李新等［26］也在檢測50 例前列腺上皮內瘤變組織、69 例前列腺癌、30 例良性前列腺增生中ATG5 的表達情況時發現，ATG5 的表達上調可能在前列腺癌的發生發展中起作用。有此可見ATG5 在多種腫瘤中均呈現高表達狀態，然而ATG5 在胃癌發展過程中的研究較為少見，本研究從核酸和蛋白兩個水平上檢測得知，ATG5在不典型增生組和胃癌組織中的mRNA 和蛋白表達顯著高于正常組，提示隨著腫瘤的逐步進展，ATG5 的表達水平越來越高，自噬作用越來越強。同時，ATG5 與胃癌的浸潤深度、分化程度和淋巴結轉移均有密切關系，而與患者的年齡、性別無明顯相關。相比未侵及外膜，高、中分化胃癌，無淋巴結轉移者，ATG5 蛋白在侵及外膜，低分化，有淋巴結轉移的胃癌組織中的自噬水平進一步上調，推測惡性程度越高和進展期胃癌的自噬活性水平明顯上調，并且腫瘤細胞可通過上調自身自噬水平來促進其增殖生長［18］，提示ATG5 相關的自噬水平上調對胃癌的發展具有重要促進作用。

此外，既往研究常分析LC3、ATG5 等單一因子對胃癌的發生發展作用的意義，與之對比，本研究通過Pearson 相關分析首次發現ATG5 與LC3 蛋白在胃癌發展不同階段呈正相關，提示LC3 和ATG5兩者互為調控，在胃癌的發生、發展過程中發揮協同作用。

綜上所述，胃癌的發生發展可能與LC3 和ATG5 自噬活性增強有關，且LC3 和ATG5 可能在促進胃癌的發生發展中起相互協同的作用，進而對胃癌的診治提供潛在的臨床應用價值。但目前有關自噬在胃癌中的作用仍存有爭議，不同類型、不同階段的胃癌，自噬水平不同導致的預后也會不同。因此，進一步開展大樣本的臨床研究以明確自噬對不同類型、不同階段的胃癌預后的影響。