乳腺癌缺氧誘導(dǎo)因子-1α、Ki-67表達(dá)與超聲聲像特征的關(guān)系

迪拉熱·努爾太，熱娜古力·阿不都熱以木，依馬木，張利

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院1超聲科，2普外科，烏魯木齊 830001

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，隨病情進(jìn)展，患者的病死率和致殘率明顯上升[1]，且在部分高危人群中，乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險可持續(xù)上升[2]。乳腺癌的相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子可以在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的改變過程中發(fā)揮重要作用。腫瘤相關(guān)蛋白的改變，可通過影響腫瘤細(xì)胞的浸潤和黏附能力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控的異常，最終促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)水平升高，可通過改變腫瘤微環(huán)境，加劇腫瘤干細(xì)胞的異常增殖，促進(jìn)乳腺癌的疾病進(jìn)展[3]；Ki-67是增殖相關(guān)調(diào)控因子，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞核的DNA，能夠明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)異常分裂，增加腫瘤細(xì)胞的異常分化成熟的風(fēng)險[4]。本研究旨在探討Ki-67、HIF-1α的表達(dá)與乳腺癌患者超聲聲像特征的關(guān)系，從而進(jìn)一步闡述乳腺癌的發(fā)生機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年9月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收治的乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合中華醫(yī)學(xué)會制定的《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015版）》中關(guān)于乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，均經(jīng)病理學(xué)檢查證實為乳腺癌；②年齡≤65歲；③獲取病理學(xué)標(biāo)本前，患者未接受放化療和免疫學(xué)治療；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并精神疾病、免疫系統(tǒng)疾病；②合并肝腎功能損害的患者；③其他部位惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入110例女性乳腺癌患者，年齡35～65歲，平均年齡為（52.5±10.0）歲；腫瘤直徑為（2.8±0.9）cm；TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期34例，Ⅲ期39例，Ⅳ期9例；分化程度：高分化31例，中分化49例，低分化30例。

1.2 檢測方法

1.2.1 超聲檢測方法 采用Logic 906系列超聲檢測儀（美國GE公司）進(jìn)行檢測，探頭為11 L，探頭頻率設(shè)置為6.5 MHz，觀察乳腺癌患者的腫塊大小、位置及邊緣情況，重點(diǎn)觀察毛刺征、腫塊形態(tài)、鈣化灶形態(tài)和血流顯像分級，血流顯像分級采用Adler分級模式，分為0～1級和2～3級。

1.2.2 免疫組化法檢測Ki-67、HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)率 取乳腺癌患者的乳腺癌組織，石蠟切片，二甲苯脫臘水化，5%的過氧化氫常溫孵育10 min，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）孵育5 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min，5%的山羊血清抗體封閉10 min，不沖洗。滴加一抗（稀釋濃度為1∶500），4℃冰箱孵育過夜，蒸餾水沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記好的二抗（稀釋濃度為1∶1000），37℃孵育30 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min。滴加二代辣根酶標(biāo)記的工作液，37℃孵育10 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min，顯色后采用酒精脫水、二甲苯透明、樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.3 免疫組化法檢測結(jié)果判定 Ki-67蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，HIF-1α蛋白主要定位在細(xì)胞核，當(dāng)二者出現(xiàn)黃色、棕黃色、褐色顆粒時，說明為陽性表達(dá)。根據(jù)細(xì)胞的著色程度進(jìn)行評分：無著色0分，淡黃色染色為1分，棕黃色染色為2分，褐色或黑色染色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分：陽性細(xì)胞所占比例≤10%為1分，陽性細(xì)胞占比例為11%～50%為2分，陽性細(xì)胞所占比例為51%～75%為3分，陽性細(xì)胞所占比例＞75%為4分。將著色程度評分與陽性細(xì)胞所占比例評分相乘：＜3分為HIF-1α、Ki-67表達(dá)陰性，≥3分為HIF-1α、Ki-67表達(dá)陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中Ki-67、HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)情況

110例乳腺癌患者中，43例患者既存在Ki-67蛋白陽性表達(dá)又存在HIF-1α蛋白陽性表達(dá)，35例患者僅存在Ki-67蛋白陽性表達(dá)，13例患者僅存在HIF-1α蛋白陽性表達(dá)，Ki-67、HIF-1α蛋白陰性表達(dá)患者共19例。乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67蛋白的陽性表達(dá)率為70.91%（78/110），HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)率為50.91%（56/110）。

2.2 不同聲像特征乳腺癌患者乳腺癌組織Ki-67、HIF-1α蛋白陽性表達(dá)率的比較

不同腫塊直徑、毛刺征情況乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫塊形態(tài)、鈣化灶形態(tài)、血流顯像分級乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同腫塊直徑、毛刺征情況、腫塊形態(tài)、鈣化灶形態(tài)乳腺癌患者乳腺癌組織中HIF-1α蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同血流顯像分級乳腺癌患者乳腺癌組織中HIF-1α蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同聲像特征乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67、HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)情況

3 討論

乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的持續(xù)性異常分裂或乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）基因的異常突變，均可明顯促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展，合并乳腺癌家族史的人群，相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險可進(jìn)一步上升[6]。乳腺癌患者的總體生存時間較短，治療的總體病情緩解率較低，遠(yuǎn)期病死的風(fēng)險仍然較高[7]。目前，臨床缺乏對于乳腺癌患者影像學(xué)評估指標(biāo)，雖然癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）或糖類抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）能夠在乳腺癌的病情評估過程中發(fā)揮作用，但依靠CEA等指標(biāo)評估乳腺癌患者影像學(xué)特征的靈敏度較低，其對乳腺癌超聲影像特征評估的一致性不足40%[8]。本研究探討HIF-1α、Ki-67的表達(dá)與乳腺癌患者超聲影像特征的關(guān)系，進(jìn)一步充實了乳腺癌患者影像學(xué)特征的檢測靈敏度，從而能夠進(jìn)一步深入揭示乳腺癌的發(fā)生機(jī)制。

HIF-1α是缺氧誘導(dǎo)因子，可能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的異常分裂，促進(jìn)乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的異常增殖，最終促進(jìn)乳腺癌的疾病進(jìn)展。基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究也證實，HIF-1α表達(dá)上調(diào)還可改變?nèi)橄侔┠[瘤干細(xì)胞特征，導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞發(fā)生持續(xù)性自我增殖[9]。Ki-67是細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原，可激活腫瘤細(xì)胞核上游轉(zhuǎn)錄基因，提高腫瘤細(xì)胞紡錘體或細(xì)胞器的合成和分裂速度。Ki-67還能夠明顯改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，從而改變腫瘤細(xì)胞的浸潤和黏附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[10-11]。目前的研究多探討Ki-67的表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者Ki-67的表達(dá)水平明顯升高[12]，但缺乏HIF-1α、Ki-67蛋白的表達(dá)與乳腺癌腫塊性質(zhì)或血流分級的關(guān)系研究。

本研究結(jié)果顯示，不同腫塊直徑、毛刺征情況乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明毛刺樣改變與Ki-67的表達(dá)無明顯的關(guān)系。但不規(guī)則腫塊、桿狀鈣化灶、3～4級血流顯像分級的乳腺癌患者乳腺癌組織中Ki-67蛋白陽性表達(dá)率高于類圓形腫塊、細(xì)沙狀或顆粒狀鈣化灶、1～2級血流顯像分級的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明Ki-67的表達(dá)與乳腺癌患者的超聲影像特征密切相關(guān)，這主要由于Ki-67表達(dá)水平升高，可通過提高腫瘤細(xì)胞的增殖不規(guī)律性，增加了腫塊形態(tài)的不規(guī)則性；且由于Ki-67對乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞浸潤的影響，導(dǎo)致了腫塊中間腫瘤細(xì)胞的異常鈣化，促進(jìn)了鈣化腫瘤細(xì)胞的黏附和桿狀黏附作用，最終促進(jìn)了桿狀鈣化灶的發(fā)生；而Ki-67陽性表達(dá)率較高的乳腺癌患者血流分級較高，這主要由于Ki-67表達(dá)水平升高，能夠通過誘導(dǎo)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，增加了腫瘤血流灌注的分支數(shù)量和血流量，從而導(dǎo)致血流分級的上升。劉淳等[13]研究結(jié)果顯示，在具有明顯的血流分級上升的乳腺癌患者中，Ki-67的表達(dá)陽性率明顯上升，同時在腫塊邊緣不規(guī)則或具有明顯不典型鈣化灶的患者中，Ki-67的表達(dá)陽性率可持續(xù)上升。本研究結(jié)果顯示，3～4級血流顯像分級乳腺癌患者乳腺癌組織中HIF-1α的陽性表達(dá)率高于1～2級血流顯像分級的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這主要是因為HIF-1α誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境，能夠明顯促進(jìn)腫瘤新生血管生成和腫瘤血管的重塑性改變，最終促進(jìn)血流分級的上升[14-15]。本研究并未發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)與腫塊形態(tài)或鈣化灶特征的關(guān)系，表明HIF-1α的表達(dá)與乳腺癌患者的一般性腫塊特征并無明確的關(guān)系。

綜上所述，乳腺癌患者乳腺癌組織中HIF-1α的表達(dá)可能與血流顯像分級有關(guān)，Ki-67的表達(dá)可能與腫塊形態(tài)、鈣化灶形態(tài)及血流顯像分級有關(guān)。