導致原發性Ⅰ型腎小管酸中毒的SLC4A1突變R388C致病機制的細胞學研究

潘鑫，李亞彩，王曉黎

（中國醫科大學附屬第一醫院內分泌科，內分泌研究所，遼寧省內分泌疾病重點實驗室，沈陽 110001）

Ⅰ型腎小管酸中毒又被稱為遠端腎小管酸中毒 （distal renal tubular acidosis，dRTA），在成人中常繼發于其他疾病，如慢性肝臟疾病、自身免疫性疾病、腎移植、藥物性腎損傷等。原發性dRTA多見于兒童，致病基因主要為編碼位于頂膜H+-ATP酶B1和A4亞單位的ATP6V1B1（MIM：192132） 基 因和ATP6V0A4（MIM：605239） 基因，以及編碼基底膜陰離子 （Cl-/HCO3-） 轉運體1 （anion exchanger 1，AE1） 的SLC4A1（MIM：109270） 基因［1-2］，其他基因還包括FOXI1（MIM：601093） 基 因［3］和WDR72（MIM：613214） 基因［4］，但較為少見，除此之外還有15%左右的基因位點不明［2，5］。典型dRTA的臨床表現為慢性代謝性酸中毒、低鉀血癥、高尿鈣、腎臟鈣質沉著和腎結石，尿液偏堿性。但原發性dRTA的臨床表現異質性較強，部分不典型dRTA患者有可能至成年后才得到確診，容易延誤診治［6-7］。本文對我院診斷為dRTA的1例成人患者及其父親攜帶的一處新型SLC4A1基因雜合性突變R388C進行了細胞學研究，證實了該突變是導致dRTA的致病原因，并總結了目前已知的可導致dRTA的SLC4A1基因突變的類型和特點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為2018年在我院因低鉀血癥就診、經基因診斷為原發性dRTA的1例患者及其父親，2人均接受了病史采集、甲狀腺功能、腎功能、尿常規、甲狀腺和腎上腺相關激素以及影像學檢查等，明確低鉀血癥的病因，并進行了二代基因測序。本研究已通過我院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 檢測方法

采用全自動生化儀檢測肝腎功能、血離子，采用免疫化學發光法測定促腎上腺皮質激素、皮質醇等。采用放射免疫法測定腎素、血管緊張素、醛固酮、胰島素等。

提取患者及其父親基因組DNA，利用經過生物素標記的探針 （P039-Exome，北京邁基諾公司） 與文庫DNA雜交，進行外顯子捕獲，在NextSeq 500 （美國Illumina公司） 上進行高通量測序，測序數據經Burrows-Wheeler Aligner （v.0.7.10-r1039） 軟件將其比對到人類基因組并分析 （基因組版本為GRCh37/hg19）。重點篩查與低鉀血癥臨床表型相關的基因，并對檢出的基因突變位點在患者及其父親中采用一代測序驗證。

1.3 細胞學實驗

使 用GV230 （CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，吉凱基因） 質粒，利用XhoⅠ/KpnⅠ酶切位點導入野生型SLC4A1基因序列 （NM_000342） 和其突變型 （R388C） 基因序列，測序驗證后，抽提質粒并保存。培養HEK-293細胞至80%融合度后，利用Lipofectamine 2000試劑盒 （美國 Invitrogen公司） 轉染上述質粒至細胞。培養48 h后利用熒光顯微鏡 （德國徠卡公司） 觀察細胞形態。

2 結果

2.1 臨床資料

患者，男，30歲，既往有發作性軟癱7年的病史，常因為天氣變涼而誘發，實驗室檢查發現間斷低鉀血癥 （入院后血鉀3.33 mmol/L），長期自行補鉀治療。家族史：父親有類似表現，但未經系統診治。患者無腎損傷相關用藥史和其他肝臟疾病、自身免疫性疾病病史，完善了其他低鉀血癥病因的相關檢查，如腎上腺增強3D-CT未見異常，促腎上腺皮質激素-皮質醇節律和測定值在正常范圍，腎素-血管緊張素-醛固酮水平正常，風濕抗體系列正常。因臨床表現不典型，且存在家族史，故行二代測序明確低鉀原因。

2.2 基因檢測結果

全外顯子組測序提示，患者攜帶一處位于SLC4A1基因 （NM_000342） 第11外顯子上的雜合性突變 （c.1162C>T，p.Arg388Cys）。Sanger測序驗證了本突變，并且對患者親屬的相應位點進行了測序，發現患者父親攜帶相同突變 （圖1A、1B）。

2.3 細胞學實驗

圖1 患者的家系圖和基因測序結果和SLC4A1基因突變示意圖Fig.1 Pedigree of the kindred and sequencing result of SLC4A1 gene with schematic diagram of the mutation sites

將攜帶野生型和突變型SLC4A1基因序列的GV230質粒轉染到HEK-293細胞后，培養48 h后在熒光顯微鏡下觀察發現，轉染野生型SLC4A1質粒的細胞可見SLC4A1綠色熒光蛋白分布于細胞表面，提示蛋白合成后可轉運至正常位置；而轉染突變型SLC4A1質粒的細胞可見SLC4A1綠色熒光蛋白分布在細胞質內，無法達到細胞表面，不能發揮正常作用 （圖2）。

圖2 轉染野生型kAE1和野生型kAE1質粒的HEK293細胞 ×200Fig.2 HEK293 cells transfected with wild-type kAE1 and wildtype kAE1 plasmid ×200

3 討論

dRTA分為原發性和繼發性，繼發性因素包括慢性肝臟疾病、自身免疫性疾病、腎移植、藥物性腎損傷等，多見于成人。而原發性dRTA多為嬰幼兒起病，甚至不能成活，成人起病較為少見，多為不完全性或非經典性，因此較難鑒別，需細致除外繼發性因素。典型dRTA的臨床表現包括軟癱或抽搐等低鉀血癥表現、骨骼異常表現 （成人骨軟化癥、兒童佝僂病、骨折、骨痛等）、感覺神經性耳聾等，實驗室檢查會發現陰離子間隙正常的代謝性酸中毒、低鉀血癥、高尿鈣、尿液pH值增高，必要時可完善氯化銨試驗，判斷腎小管的酸化功能。影像學檢查會發現腎臟鈣質沉著 （常見） 和腎結石 （少見），骨骼呈佝僂病樣改變，在部分聽力減低的患者中，內耳CT檢查可發現前庭導水管擴張［5］。本文的患者以低鉀血癥就診，起病年齡較早，并且與其父親有相似的臨床表現，因此考慮遺傳性疾病的可能性。由于患者癥狀不典型，并無其他dRTA臨床表現，因此并未首先考慮遺傳性dRTA，而是直接進行了二代測序以明確低鉀血癥的病因，這體現了二代測序在診斷不典型遺傳性疾病中的優勢。

以往認為遺傳性dRTA的致病基因主要為ATP6V1B1基因、ATP6V0A4基因和SLC4A1基因，其中最多見的為ATP6V1B1基因和ATP6V0A4基因 （共占70%），SLC4A1基因突變約占15%左右［2，5］，新近有個例報道FOXI1基因［3］和WDR72基因突變也可以導致遺傳性dRTA［4］，此外還有15%的患者家系存在未知的基因突變位點。由于遺傳性dRTA的致病基因較多，因此在臨床中可疑遺傳性dRTA的患者同樣應推薦進行性價比較高的二代測序進行基因診斷。

通常ATP6V1B1、ATP6V0A4、FOXI1和WDR72基因突變導致的dRTA的臨床表現 （代謝性酸中毒和低鉀血癥） 要比SLC4A1基因突變導致的dRTA嚴重 （前3個基因突變的臨床表現常伴隨耳聾）［3-4，8］。SLC4A1基因編碼的蛋白可在腎臟和紅細胞膜中表達，在紅細胞膜中表達的AE1又稱為帶3蛋白，是紅細胞膜的重要組成成分，因此部分突變類型可造成遺傳性球形紅細胞血癥，從而導致溶血性貧血。在腎臟的α閏細胞中表達的AE1又稱為kAE1，可使碳酸氫根與氯離子交換并重吸收入血液。因此，其功能受損會導致酸中毒、低血鉀、尿鈣增加等一系列dRTA的臨床表現。

目前文獻已報道導致dRTA的SLC4A1基因突變有36處，遺傳模式根據突變類型不同可表現為常染色體顯性遺傳 （autosomal dominant，AD） 或常染色體隱性遺傳 （autosomal recessive，AR）［9-10］，熱點區域為第11、13、15和20外顯子。AD dRTA的發生機制為kAE1二聚體中的雜合性突變蛋白導致正常kAE1蛋白的運輸障礙，又稱之為“顯性-隱形效應”，如R589H和S613F［11］，以及集中于C端第20外顯子的突變，如A888L/D889X （del20bp）［7］、R901X （ins13bp）［12］、D902N［13］、D905dupCGA （ins3bp）［14］、D905G fs15（ins1bp）［15］、E906Q［16］和M909T［17］。而導致AR dRTA最常見的位點是位于第17外顯子的G701D［14，18］。本例患者的SLC4A1基因突變R388C位于第11外顯子，系kAE1蛋白N端的雙性螺旋1 區域 （H1區域），屬于高度保守區域，推測R388C可能會引起kAE1構像上的變化，造成其與野生型kAE1形成的雜合二聚體停留在內質網內，無法正常轉運至胞膜發揮正常的作用，這也在本研究的細胞實驗中得到了證實，在遺傳模式和致病機制方面都符合AD 模式的dRTA。SLC4A1基因突變導致的dRTA臨床表現異質性較強，甚至相同突變的表現也不盡一致，通常AD模式的臨床表現要輕于AR模式［1］。本例患者及其父親起病時間長，就診時無酸中毒表現，僅表現為間斷低鉀血癥、堿性尿和高尿鈣，父親甚至常年未正式就醫，這與其他AD模式的dRTA臨床表現相似［6-7，13］。

dRTA的治療首要是要及時糾正酸中毒和低鉀血癥，從而避免出現急性癥狀和降低慢性并發癥的嚴重程度 （如生長遲緩、腎鈣質沉著、骨軟化、腎小球濾過率下降等），通常選擇堿性藥物如枸櫞酸鉀、枸櫞酸鈉等；其次是要定期隨訪，監測血氣分析、血離子、尿離子、腎臟超聲、骨密度、聽力等；三是建議做基因檢測，可以選擇二代測序，并合理的進行遺傳咨詢［1］。

綜上所述，本文對文獻中已報道的SLC4A1基因突變進行了歸納總結，并對前期發現的位于SLC4A1基因H1區域的一處突變R388C進行了發病機制的探討，細胞學實驗證實突變的kAE1蛋白無法達到細胞表面發揮正常的離子轉運功能，提示本突變是造成AD dRTA的分子基礎。