食品中李斯特氏菌的分離鑒定

□ 郭瑞軍 濮陽市食品藥品檢驗檢測中心

□ 秦政 河南大學國際教育學院

1 引言

李斯特氏菌屬是革蘭氏陽性桿菌，屬內有兩個種具有致病性，即單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和伊氏李斯特菌（L.ivanovii），前者致病性強，是重要的食源性致病菌之一，人體感染后的主要臨床表現有敗血癥、腦膜炎等。單核細胞增生李斯特氏菌往往存在于肉制品和乳制品中，并能夠在低溫條件下繁殖，因其嚴重威脅人類健康，故我國食品中致病菌限量標準規定該菌不得檢出。

英諾克李斯特氏菌（L.innocua）雖無致病性，卻在食物中廣泛存在。通過查閱國內相關論文研究來分析李斯特氏菌對我國食品的污染狀況，結果顯示在所有食物類型中，英諾克李斯特氏菌的檢出率最高，其次為單核細胞增生李斯特氏菌[1]。駱玲飛等[2]通過對320份食品進行檢驗發現，英諾克李斯特氏菌的檢出率為7.19%，共計23株，占檢出李斯特氏菌總數的63.89%，這表明該菌會給食品安全帶來極大隱患。此外，由于英諾克李斯特氏菌與單核細胞增生李斯特氏菌較為相似，且不易區分，因此容易造成誤判[3-4]。本研究通過對河南省濮陽市市售涼皮進行檢驗，分離出一株李斯特氏菌，利用單增李斯特氏菌生化鑒定條和VITEK 2 Compact進行鑒定，以判定該菌是否為單核細胞增生李斯特氏菌，希望能夠為李斯特氏菌的準確鑒定提供參考依據。

表1 單增李斯特氏菌生化鑒定條結果

2 材料與方法

2.1 材料

河南省濮陽市市售涼皮。

2.2 方法

按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30-2016）進行檢驗。樣品經過兩次增菌（LB1、LB2）培養后，劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板上，在36℃培養箱中培養24～48h后，挑選典型菌落進行木糖和鼠李糖生化試驗，同時劃線接種到TSA-YE平板上。

在對木糖陰性、鼠李糖陽性的菌落進行革蘭氏染色、動力試驗和溶血試驗的同時，利用單增李斯特氏菌生化鑒定條和VITEK 2 Compact進行檢驗。

3. 實驗結果

3.1 分離初篩

取LB2培養液接種到選擇性瓊脂平板上進行培養觀察發現，李斯特氏菌顯色平板上出現藍綠色菌落，PALCAM瓊脂平板上出現灰綠色菌落。挑取選擇性瓊脂平板上的典型菌落劃線接種到TSA-YE平板上，同時接種到木糖和鼠李糖發酵管中進行培養。結果顯示，木糖為陰性，鼠李糖為陽性。

表2 VITEK 2 Compact生化鑒定結果

3.2 鏡檢和動力試驗

利用革蘭氏染色液試劑盒對TSA-YE平板上的菌落進行染色，顯微鏡下觀察菌株為革蘭氏陽性短桿菌。用接種針挑取菌落穿刺接種到SIM生化管中，30℃培養48h后觀察發現，菌落沿穿刺線呈傘狀生長。

3.3 生化鑒定結果

利用單增李斯特氏菌生化鑒定條對TSA-YE平板上的可疑菌落進行檢驗，結果顯示，僅木糖和甘露醇兩項生化試驗結果為陰性，過氧化氫酶、葡萄糖和麥芽糖等生化試驗結果均為陽性（見表1），由此判定該菌株為單核細胞增生李斯特氏菌或英諾克李斯特氏菌。

3.4 溶血試驗

將純化培養后的可疑菌落劃線接種到血瓊脂平板上，36℃培養48h后于明亮處觀察，發現菌落周圍無溶血圈，由此判定該菌株為英諾克李斯特氏菌。

3.5 VITEK 2 Compact鑒定結果

挑取TSA-YE平板上的可疑菌落劃線接種到含5%羊血的胰酶大豆瓊脂（TSAB）上，36℃培養18～24h后制成0.5～0.63McF的菌懸液并上機檢驗，8h后給出分析報告。結果顯示，D-木糖（dXYL）和D-甘露醇（dMAN）等26項生化試驗結果為陰性，D-麥芽糖（dMAL）等17項生化試驗結果為陽性（見表2），無不吻合的典型生化譜，故結果判定為英諾克李斯特氏菌（概率為99%），為極好的鑒定。

4 討論

常規檢驗過程中，溶血試驗是區分單核細胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌的關鍵。國標方法指出，溶血試驗中的菌落接種分為刺種和劃線兩種方法。刺種過程中可以將血平板劃分成20～25個小格，每個小格接種一個可疑菌落，即讓多個菌落集中在同一個平板上，便于對比觀察且節約成本。然而，該方法對檢驗人員的操作要求較高—穿刺時要盡量接近血平板底部而又不能刺破，否則會影響試驗結果。劃線接種方法方便快捷，適合少量樣品的檢驗，但劃線過程需按標準操作，避免菌落連成一片，進而影響結果判定。

VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統具有自動化程度高、速度快、準確性好等特點，在食品安全檢驗中具有重要的應用價值。同時，該系統對上機檢驗的樣品要求較高—對菌液的純度、濃度和培養時間等有著嚴格要求。通過比對單核細胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌的43項生化鑒定結果，發現兩種菌存在PIPLC、LeuA和LAC這3項生化試驗結果不同[5]。有研究指出，VITEK 2 Compact不能有效區分單核細胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌[4-6]，而李苗苗[7]的研究結果與該結論不同，且本研究已利用VITEK 2 Compact準確鑒定出可疑菌落為英諾克李斯特氏菌。由于VITEK 2 Compact偶爾不能有效區分單核細胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌，因此在實驗室條件允許的情況下，建議采用多種方法綜合判定，確保準確鑒定李斯特氏菌。