白細胞介素-8沉默對喉鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響及機制研究

張潛英，唐正琪，郝成羅，岳顯，馬麗梅，陳鴻雁

自貢市第三人民醫院1耳鼻咽喉頭頸外科，2腫瘤科，3病理科，四川 自貢 643020

4重慶醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 400016

白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是最早發現的趨化因子，可在促進中性粒細胞趨化和脫粒中發揮重要作用[1-3]。研究顯示，IL-8可以激活G蛋白偶聯受體[包括CXC趨化因子受體1（C-X-C chemokine receptor 1，CXCR1）和CXC趨化因子受體2（C-X-C chemokine receptor 2，CXCR2）]下游的多種細胞內信號通路[4-5]。研究顯示，IL-8及其受體在多種腫瘤細胞、內皮細胞、浸潤性中性粒細胞和腫瘤相關的巨噬細胞中表達均上調[6-9]，表明IL-8可能在腫瘤微環境中發揮關鍵調控因子的作用。既往研究表明，IL-8表達上調與腫瘤形成、進展及血管形成密切相關[4]。研究表明，IL-8在腫瘤血管生成中發揮重要作用，可促進肺癌及胃癌細胞的侵襲和轉移過程[2,4,8-9]；IL-8也可以通過調控基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表達促進腫瘤細胞增殖、遷移和淋巴結轉移[3,5,7]。目前，研究者已對IL-8在多種惡性腫瘤中的作用進行了研究，但其在喉鱗狀細胞癌中的研究仍然較少。

喉鱗狀細胞癌是頭頸部腫瘤中惡性程度最高的腫瘤之一[10-12]，雖然發病率和病死率逐年降低，但其現狀仍不樂觀[13]。數據顯示，2013年美國喉鱗狀細胞癌新發12 260例，病死3630例[14]。雖然喉鱗狀細胞癌的發病率和病死率較低，但咳嗽、呼吸困難和吞咽困難等由其引起的并發癥可導致患者預后較差，此外，臨床對分化程度較高的喉鱗狀細胞癌患者的診斷和治療仍較困難[15-17]。本研究旨在探討沉默IL-8的表達對喉鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響，以及對凋亡相關因子cleaved caspase 3、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）表達的影響。另外，龐雪莉等[18]研究發現，IL-8可通過激活磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路進而抑制乳腺癌細胞的凋亡。因此，本研究進一步對IL-8的分子機制進行了研究，旨在為喉鱗狀細胞癌的有效治療奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞系購自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自江蘇四季青生物公司，IL-8小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購自上海杰李生物技術有限公司，Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Thermo Fisher公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液均購自上海生工生物工程有限公司，IL-8抗體購自美國Abcam公司，AKT、磷酸化AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國CST公司，噻唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）試劑均購自美國Sigma公司，膜聯蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和分組 喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞系在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養。將IL-8siRNA和Lipofectamine 2000轉染試劑轉染至喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞作為實驗組將僅加入Lipofectamine 2000轉染試劑的喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞作為NC組，未做處理的細胞作為空白組。實驗重復3次。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖能力 取3組喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞接種于96孔板，培養48 h后向3組細胞中加入0.5 mg/ml的MTT溶液，培養箱中孵育4 h，棄去MTT溶液后，每孔加入150 μl的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），搖床振蕩10 min，采用酶標儀490 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值。實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取3組喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞，采用預冷的PBS沖洗2次，采用的0.25%的胰蛋白酶消化50 s，立即采用細胞培養基中和胰蛋白酶。收集細胞至1.5 ml的離心管中，1000 r/min，4℃離心4 min，除去上清液，收集細胞后采用500 μl的1×結合緩沖液（binding buffer）重懸，每管取100 μl細胞懸液，加入5 μl FITCAnnexin Ⅴ孵育15 min，加入5 μl PI孵育15 min。室溫孵育15 min，采用流式細胞儀檢測3組細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測8、AKT、p-AKT、cleaved caspase3、Bcl-2、BAX蛋白相對表達量 取3組喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞，采用預冷的PBS沖洗2次，接種于6孔板，每孔加入100 μl的蛋白裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑），收集細胞至1.5ml離心管中，采用細胞超聲破碎儀10%的功率破碎細胞。冰上放置5 min充分裂解后，12000 r/min，4℃離心20 min，提取上清液至新的離心管中，提取細胞中的總蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定各蛋白的濃度，將蛋白樣品配制成1×負載緩沖液（loading buffer），使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）分離蛋白樣品，電泳結束后，利用濕轉法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜上，100Ⅴ恒壓轉移1.5 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution toween，PBST）溶液沖洗3次。加入一抗4℃過夜孵育，PBST溶液洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后，以電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）法顯影，在凝膠成像系統中曝光、拍照，采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對所有數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖能力的比較

實驗組喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞中IL-8蛋白的相對表達量為（0.38±0.10），明顯低于NC組細胞的（0.77±0.14）和空白組細胞的（0.72±0.12），差異均有統計學意義（t=6.412、6.156，P＜0.01）。實驗組喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的OD值為（0.64±0.09），明顯低于NC組細胞的（0.98±0.10）和空白組細胞的（1.00±0.13），差異均有統計學意義（t=7.148、6.440，P＜0.01）。

2.2 細胞凋亡情況的比較

實驗組喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的凋亡率為（41.63±3.76）%，明顯高于空白組細胞的（3.22±0.86）%和NC組細胞的（7.25±1.46）%，差異均有統計學意義（t=28.171、24.109，P＜0.01）。（圖1）

圖1 流式細胞儀檢測3組喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的凋亡情況

2.3 AKT、p-AKT、cleaved caspase3、Bcl-2、BAX蛋白相對表達量的比較

實驗組Hep-2細胞中p-AKT和抑制凋亡蛋白Bcl-2的相對表達量均低于空白組和NC組細胞，而促凋亡蛋白BAX和cleaved caspase 3的相對表達量均高于空白組和NC組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）。但3組Hep-2細胞AKT蛋白的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表1）。

表1 3組細胞IL-8、AKT、p-AKT、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX蛋白的相對表達量的比較（±s）

表1 3組細胞IL-8、AKT、p-AKT、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX蛋白的相對表達量的比較（±s）

注：a與NC組比較，P＜0.05；b與空白組比較，P＜0.05

蛋白A K T p-A K T c l e a v e d c a s p a s e 3 B c l-2 B A X實驗組0.9 2±0.1 8 0.4 4±0.1 1 a b 0.5 1±0.1 3 a b 0.4 5±0.1 2 a b 0.3 7±0.0 8 a b N C組0.9 5±0.2 0 0.7 1±0.1 5 0.3 6±0.0 9 0.6 7±0.1 5 0.2 2±0.0 6空白組0.9 6±0.1 8 0.7 6±0.1 7 0.3 4±0.0 8 0.6 4±0.1 4 0.2 4±0.0 6

3 討論

腫瘤細胞與癌旁細胞的相互作用，包括多種細胞因子介導的細胞間相互作用，在腫瘤進展中均發揮重要作用[2,5,7]。IL-8也被稱為趨化因子配體8（C-X-C chemokine ligand 8，CXCL8），對中性粒細胞具有趨化作用，并可通過與相應的受體結合調控細胞生物學過程[3,7]。IL-8的受體包括CXCR1和CXCR2，這是一類跨膜的G蛋白偶聯受體，其下游的多種細胞內信號通路在細胞存活、增殖和凋亡等生物進程中發揮關鍵作用[1,6,8]。多項研究表明，IL-8及其受體在多種腫瘤細胞、內皮細胞、浸潤性中性粒細胞及腫瘤相關的巨噬細胞中表達上調[3,7,9]。腫瘤相關研究結果顯示，IL-8對腫瘤新生血管生成、中性粒細胞向腫瘤位點募集和腫瘤細胞存活、增殖和轉移均具有重要作用[2,8]。但目前對IL-8在喉鱗狀細胞癌中作用的研究較少，其在喉鱗狀細胞癌中的具體作用機制尚不明確。

喉鱗狀細胞癌作為頭頸部腫瘤中惡性程度最高的腫瘤之一[12,17]，盡管目前已有多種診斷和治療手段應用于臨床，但喉鱗狀細胞癌患者的生存率一直較低[19-20]。這可能是因為臨床針對喉鱗狀細胞癌的發生發展及惡性進展機制尚未完全明確，導致臨床對組織學分級較高的喉鱗狀細胞癌患者的診斷和治療較困難[21]。因此，本研究旨在探討喉鱗狀細胞癌的發生發展機制，為臨床診斷和治療提供新的靶點和策略。

本研究結果顯示，IL-8siRNA可抑制喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的增殖能力，采用流式細胞儀進一步檢測細胞凋亡情況，結果顯示，IL-8siRNA可促進喉鱗狀細胞癌Hep-2的凋亡，表明IL-8可能在喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖、凋亡等生物學過程中發揮關鍵作用。本研究通過檢測PI3K/AKT信號通路的激活情況及凋亡相關蛋白的相對表達量，結果表明，IL-8可通過對PI3K/AKT相關信號通路的調控，抑制喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的增殖能力，并促進其凋亡。

綜上所述，IL-8可通過對PI3K/AKT相關信號通路的調控，抑制喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的增殖能力，并促進其凋亡，為喉鱗狀細胞癌的診斷和治療提供了新的靶點及可能的治療策略。