microRNA-214在胃癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義

謝良寶，高凌，馮亞光，張玉文

商丘市第一人民醫(yī)院1胃腸肝膽外科，2病理科，河南 商丘 476100

胃癌是臨床常見的胃腸道惡性腫瘤，在中國，其在胃腸道惡性腫瘤中的發(fā)病率位居首位，嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量和生命健康[1]。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，胃癌的治療取得了一定的進(jìn)展，但胃癌患者的總體治療效果及預(yù)后仍較差[2]。胃癌的發(fā)生可能與地域、環(huán)境、生活習(xí)慣、幽門螺桿菌感染、癌前病變、遺傳和基因等因素有關(guān)，患者發(fā)病初期通常無特異性臨床表現(xiàn)，部分患者存在惡心、嘔吐等癥狀，早期胃癌的診斷較為困難[3]。截至目前，胃癌的具體發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制仍未明確，因此，臨床中針對(duì)胃癌早期預(yù)防和治療的方案尚無法確定。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類小分子非編碼RNA，其在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和周期調(diào)控等過程中具有重要意義[4]。miRNA-214的特異性表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[5]，但關(guān)于其在胃癌中表達(dá)情況的研究鮮有報(bào)道。本研究探討miRNA-214在胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況與其胃癌患者臨床特征的關(guān)系，以期為胃癌的臨床診治提供新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年5月至2013年5月于商丘市第一人民醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的胃癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃腺癌；②術(shù)前無放療或化療等抗腫瘤治療史；③具備手術(shù)治療指征。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他臟器轉(zhuǎn)移；②合并心、肺、肝、腎等重要臟器功能不全；③合并其他部位惡性腫瘤；④臨床資料不完整或術(shù)后失訪。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入47例胃癌患者，其中，男26例，女21例；年齡37～80歲，平均年齡（51.8±7.4）歲；TNM分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例，Ⅳ期12例；分化程度：高分化14例，中分化17例，低分化16例；腫瘤直徑＞4 cm 25例，腫瘤直徑≤4 cm 22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。收集47例胃癌患者的胃癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁（距腫瘤邊緣≥5 cm）組織標(biāo)本進(jìn)行研究。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自日本Takara公司，ABI7500型qRT-PCR儀購自美國PE公司。

1.3 組織RNA 提取

將胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行切片，厚度為3 mm，取5 cm2大小的組織置入試管中，加入500 μl Trizol組織裂解液，劇烈振蕩30 s制成混懸液，置入1.5 ml RNase free EP管，室溫靜置2 min后加入200 μl氯仿，振蕩器振蕩20 s，室溫靜置5 min后離心處理，離心速度為10 000 r/min，離心25 min，后取上清液2 ml于EP管，加入異丙醇2 ml，混勻后離心25 min，離心速度為10 000 r/min，棄上清液。然后加入70%乙醇于EP管中，離心1 min，離心速度為10 000 r/min，棄上清液，沉淀RNA20 min，待乙醇揮發(fā)后，采用RNA試劑盒提取總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行操作。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量

采用qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA加水稀釋至2 ng/μl，加入逆轉(zhuǎn)錄溶液，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的反應(yīng)條件為16℃持續(xù)60 min，42 ℃持續(xù)30 min，85 ℃持續(xù)10 min；將剩余RNA產(chǎn)物置于-20℃環(huán)境下保存。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)cDNA產(chǎn)物進(jìn)行冷卻處理并常規(guī)稀釋，稀釋比例為 1∶400，取 2 μl樣本作為 PCR 定量檢測(cè)的模板，于ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算胃癌組織和癌旁組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 觀察指標(biāo)及隨訪

觀察并比較胃癌組織及癌旁組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量，分析胃癌組織中miRNA-214的表達(dá)情況與胃癌患者臨床特征的關(guān)系，并分析胃癌患者預(yù)后的影響因素。囑所有患者于術(shù)后1年內(nèi)每3個(gè)月、術(shù)后1～3年內(nèi)每6個(gè)月行門診復(fù)查，通過腹部計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）和血液學(xué)指標(biāo)等綜合判斷患者的術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況，記錄所有患者的術(shù)后無瘤生存情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；采用Kaplan-Merier法繪制生存曲線；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響因素進(jìn)行單因素和多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量為（4.69±0.53），明顯高于癌旁組織的（3.04±0.36），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.15，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量

不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤直徑的胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 miRNA-214表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

胃癌患者的1年無瘤生存率為85.11%（40/47），3年無瘤生存率為48.94%（23/47），中位無瘤生存時(shí)間為23個(gè)月。3年無瘤生存的23例胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量為（4.02±0.48），3年復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的24例患者胃癌組織中miRNA-214相對(duì)表達(dá)量為（5.34±0.43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.939，P＜0.05）。

2.4 胃癌患者預(yù)后影響因素的Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

根據(jù)47例胃癌患者胃癌組織中miRNA-214相對(duì)表達(dá)量的平均值4.69，將患者分為miRNA-214高表達(dá)（miRNA-214≥4.69）患者25例和miRNA-214低表達(dá)（miRNA-214＜4.69）患者22例。以性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和miRNA-214表達(dá)為自變量，以患者的3年無瘤生存為因變量，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析，結(jié)果顯示，miRNA-214高表達(dá)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化均是胃癌患者3年無瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表2、表3）

表2 47例胃癌患者3年無瘤生存影響因素的Cox單因素分析

表3 47例胃癌患者3年無瘤生存影響因素的Cox多因素分析

3 討論

胃癌具有發(fā)病率高、早期診斷率低和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，早期診斷和治療可改善胃癌患者的預(yù)后。因此，尋找靈敏度和特異度較高的腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷具有重要意義。研究表明，miRNA在多種腫瘤組織中均有特異性的表達(dá)譜，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、遷移和侵襲等多種生物學(xué)行為[6-8]。miRNA的過表達(dá)可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖具有一定的促進(jìn)作用，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。也有研究指出，miRNA可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生與抑制腫瘤發(fā)生的作用[9-10]。miRNA的異常調(diào)控通常伴隨著基因表觀遺傳學(xué)上的改變，如基因的缺失、突變以及DNA甲基化水平的異常改變等，而這些變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均密切相關(guān)。miRNA-214是miRNA中的重要組成分子，在不同惡性腫瘤中的表達(dá)水平存在差異。也有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-214在宮頸癌組織中的表達(dá)水平低于正常宮頸組織（P＜0.05），分析出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是miRNA-214通過抑制其靶基因腺苷二磷酸-核糖基化樣因子2的表達(dá)從而抑制了宮頸癌的生長(zhǎng)和侵襲[11]；此外，miRNA-214在胰腺癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)[12-14]，其可能成為腫瘤早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的重要生物標(biāo)志分子。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），提示miRNA-214在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miRNA-214的過表達(dá)對(duì)多種細(xì)胞表面分子的表達(dá)具有促進(jìn)作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移。周曉剛等[15]檢測(cè)了胃癌組織和癌旁正常胃組織中miRNA-214和PTEN蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-214通過上調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)從而影響胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲。本研究比較了不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤直徑的胃癌患者胃癌組織中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明miRNA-214在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量與胃癌的進(jìn)展可能有關(guān)。陳琳等[16]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)56例胃癌患者血漿中miRNA-214的表達(dá)情況，并分析了臨床分期與miRNA-214表達(dá)情況的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-214的表達(dá)與胃癌患者的臨床分期和生存時(shí)間均有關(guān)，提示miRNA-214可能能夠作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的靶基因，這與本研究結(jié)果一致。本研究中，Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示，miRNA-214高表達(dá)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化均是胃癌患者3年無瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而，由于多種原因，本研究對(duì)miRNA-214在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及分子機(jī)制的研究不夠深入。有研究報(bào)道，miRNA-214能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與PTEN的表達(dá)下調(diào)有關(guān)[17]。但是，miRNA-214在不同惡性腫瘤中的表達(dá)水平不同，提示miRNA-214在不同腫瘤中的差異性表達(dá)是通過調(diào)控某種癌基因或抑癌基因從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制作用[18]。因此，關(guān)于miRNA-214在胃癌中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，miRNA-214在胃癌組織中呈相對(duì)高表達(dá)，且miRNA-214高表達(dá)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化均是胃癌患者3年無瘤生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。