snoRNA87在原發性肝癌中的表達及意義

孫菲，張金仿，王克迪，蘇建榮

首都醫科大學附屬北京友誼醫院檢驗科，北京 100050

原發性肝癌是一種較為常見的消化系統惡性腫瘤，目前研究顯示，生物學標志物診斷原發性肝癌的靈敏度和特異度均較低，不能對原發性肝癌做出準確診斷[1-2]。小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）是一種非編碼RNA，是人類最早發現非編碼RNA，snoRNA定位于細胞核。隨著對snoRNA的不斷探索和深入研究，目前已知的snoRNA多達400余種，認為snoRNA其基礎作用和對核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）的修飾、功能的發揮有關[3-4]。研究認為，snoRNA與多種腫瘤的發生發展密切相關，并參與細胞周期調控，在細胞增殖中發揮重要作用，為研究調節細胞功能的相關機制提供新的研究方向[5-6]。因此，尋找診斷原發性肝癌的診斷價值較高的腫瘤標志物對患者尤為重要，本研究探討snoRNA87在原發性肝癌患者肝癌組織中的表達及意義，為原發性肝癌的診治提供新方向，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月至12月首都醫科大學附屬北京友誼醫院收治的100例原發性肝癌患者。納入標準：均經病理學診斷確診為原發性肝癌，均接受原發性肝癌手術。排除標準：既往接受過化療，合并其他腫瘤、精神障礙或其他嚴重內科疾病患者，妊娠期婦女。100例原發性肝癌患者中男53例，女47例；年齡35～75歲，＞50歲56例，≤50歲44例；腫塊個數：1個53例，≥2個47例；腫瘤直徑：＞5 cm 45例，≤5 cm 55例；合并肝硬化35例，未合并肝硬化65例；乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBⅤ）感染：乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性（HBsAg+）42例，HBsAg-58例；分化程度：低分化10例，中分化36例，高分化54例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期68例，血清甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）濃度：＞200 ng/ml 29例，≤200 ng/ml 71例。取100例原發性肝癌患者的肝癌組織及對應的癌旁組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續切片待檢。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化法檢測snoRNA87陽性表達情況將肝癌組織及癌旁組織標本置于二甲苯中脫蠟處理10 min，梯度乙醇水化；蛋白酶修復液37℃的恒溫孵化30 min，棄抗原修復液；切片移入濕盒中加入濃度為3%的過氧化氫，去過氧化物酶封閉液，恒溫冰箱孵育10 min，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗；加入適量的山羊血清，室溫環境下封閉30 min；用濾紙將封閉液吸取，加入一抗，放入濕盒，然后再加入二抗，室溫孵育1 h，采用PBS沖洗；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色處理10 min，顯微鏡下觀察，依據著色強度和陽性細胞百分比計算snoRNA87陽性表達率。

1.2.2 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測snoRNA87的相對表達量 依據試劑盒說明書提取總RNA，參照逆轉錄試劑盒操作說明，將RNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，進行PCR擴增：94℃ 3 min，94℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 1 min，共35個循環，4℃環境中保存12 h。以U6為內參，采用 2-△△Ct法計算snoRNA87的相對表達量。snoRNA87上游引物：5'-ACCCAGCTGAGGTTGTCTTT-3'，下游引物 ：5'-GGTGGCTTATGTTTGTAATCCC-3'；U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

1.2.3 隨訪方法 采用上門、電話回訪及其他通訊方法對100例患者進行為期5年的隨訪，隨訪截止2019年1月。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采Log-rank檢驗，以受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各指標診斷效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 snoRNA87陽性表達率的比較

肝癌組織中snoRNA87的陽性表達率為91%（91/100），明顯高于癌旁組織的14%（14/100），差異有統計學意義（χ2=118.877，P＜0.01）。

2.2 不同基線特征原發性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87表達情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫塊個數、肝硬化情況和HBⅤ感染情況原發性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同分化程度、TNM分期、血清AFP濃度原發性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

2.3 RT-PCR檢測snoRNA87的相對表達量

將肝癌組織中snoRNA87相對表達量＞10.00的原發性肝癌患者作為高表達組（n=62），將肝癌組織中snoRNA87相對表達量≤10的原發性肝癌患者作為低表達組（n=38），結果顯示，高表達組患者snoRNA87的相對表達量為（15.35±3.16），明顯高于低表達組患者的（3.82±1.68），差異有統計學意義（t=19.081，P＜0.01）。

表1 不同基線特征原發性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87表達情況的比較（n=100）

2.4 生存情況的比較

采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，生存率的比較采Log-rank檢驗，同時比較高表達組和低表達組患者平均生存時間、中位無進展生存期（progress free survive，PFS）和總生 存期（overall survival，OS），結果顯示，高表達組患者的5年生存率為14.52%（9/62），明顯低于低表達組患者的42.11%（16/38），差異有統計學意義（χ2=9.564，P＜0.01）；高表達組患者的5年平均生存時間為（2.13±0.50）年，明顯短于低表達組患者的（3.56±1.01）年，差異有統計學意義（t=9.439，P＜0.01）。高表達組患者的中位PFS為10.6個月，長于低表達組患者的4.5個月；中位OS為20.4個月，短于低表達組患者的32.2個月。

2.5 snoRNA87對原發性肝癌的診斷價值

snoRNA87診斷原發性肝癌的ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）為 0.734（0.577～0.980），當截斷值為38.12時，診斷靈敏度為93.12%，特異度為94.25%；當截斷值為17.59時，診斷靈敏度為97.58%，特異度為91.32%。（圖1）

圖1 snoRNA87診斷原發性肝癌的ROC曲線

3 討論

snoRNA是一種非編碼RNA，是人類最早發現非編碼RNA，主要定位在細胞核，在對微小RNA（micro RNA，miRNA）測序過程中發現，snoRNA在細胞內可經過切割形成不同長度的RNA片段，且部分snoRNA結構和功能與miRNA相同，生理狀態下，這部分具有miRNA結構和功能的snoRNA在細胞核內可同時發揮其自身功能和miRNA功能。目前研究發現，部分snoRNA可參與腫瘤發生和發展[7-8]。但目前snoRNA與原發性肝癌的關系的研究報道較少，因此，本研究探討snoRNA87在原發性肝癌患者肝癌組織中的表達及意義，為臨床上原發性肝癌的診斷提供新方向。

目前，臨床根據基因序列、結構、結合蛋白組分、修飾rRNA的功能不同，可將snoRNA分為boxC/D snoRNA、boxH/ACA snoRNA、孤兒型snoRNA、特異性小卡扎爾體snoRNA，但目前研究最為廣泛的為boxC/D snoRNA和boxH/ACA snoRNA[9-11]。張燕等[12]對snoRNA及其衍生RNA的研究進展進行分析，結果顯示，snoRNA在正常細胞功能中發揮重要作用，其可在細胞核、細胞質中同時存在，但處于不同位置的snoRNA功能、轉運機制仍不明確，還需進一步研究發現。國內外有大量研究認為，snoRNA與多種腫瘤的發生發展有關，并參與調控細胞周期，在細胞增殖中發揮重要作用，為研究調節細胞功能的相關機制提供新的研究方向[13-16]。本研究結果顯示，肝癌組織中snoRNA87的陽性表達率為91%，明顯高于癌旁組織的14%，且snoRNA87的表達可能與原發性肝癌患者的分化程度、TNM分期、血清AFP濃度有關，表明snoRNA87在原發性肝癌患者肝癌組織中表達水平較高，且可能與患者腫瘤分化程度、TNM分期、血清AFP濃度相關，參與原發性肝癌的發生與發展。研究結果顯示，snoRNA參與多種腫瘤的發生發展，可作為腫瘤診斷的特異性指標[17-20]。本研究對100例原發性肝癌患者進行為期5年的隨訪，結果顯示，高表達組患者的5年生存率為14.52%，明顯低于低表達組患者的42.11%，差異有統計學意義（P＜0.01），且snoRNA87對原發性肝癌的診斷靈敏度、特異度均較高，表明snoRNA87對原發性肝癌的診斷價值較高且可對患者的預后生存周期進行評價，但目前尚未有關于原發性肝癌患者肝癌組織中snoRNA87高表達與腫瘤發生發展關系的研究，尚需進一步深入研究。

綜上所述，snoRNA87在原發性肝癌患者肝癌組織中陽性表達率較高，且可能與原發性肝癌患者的分化程度、TNM分期和血清AFP濃度有關，對原發性肝癌的診斷價值較高。