MTDH基因和ATG7基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

張繼業(yè)，趙麗寧，王勝良

三門(mén)峽市中心醫(yī)院普外科，河南 三門(mén)峽 472000

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是高發(fā)的消 化系統(tǒng)惡性腫瘤，便血是其最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)。近年來(lái)CRC的發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì)，腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)是CRC患者死亡的常見(jiàn)原因[1]。異黏蛋白（metadherin，MTDH）基因定位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂22.5[2-3]。研究顯示，MTDH基因在肝細(xì)胞癌、胃癌、CRC和乳腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥過(guò)程中扮演重要角色[4-7]。自噬相關(guān)基因7（autophagy related7，ATG7）編碼的蛋白質(zhì)屬于E1樣泛素化連接酶可增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性，當(dāng)ATG7基因表達(dá)上調(diào)激活并誘導(dǎo)的自噬活性增強(qiáng)與CRC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8-9]。但CRC中關(guān)于MTDH基因和ATG7基因表達(dá)研究較少，本研究探討MTDH基因和ATG7基因在CRC中的表達(dá)及臨床意義，以期為臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取三門(mén)峽市中心醫(yī)院2013年7月至2018年7月的經(jīng)病理科確診后行手術(shù)切除的66例CRC患者，納入的患者術(shù)前均未接受放、化療等；排除非首次確診的患者。本研究共納入66例CRC患者，男性35例，女性31例，年齡43～84歲，平均（62.42±9.95）歲，TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第八版結(jié)直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)[10]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有研究對(duì)象及家屬均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。收集CRC患者的CRC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（距離腫瘤病灶邊緣2 cm及以上），切除組織后立即放入液氮中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用美國(guó)Invitrogen公司的Trizol試劑盒按照說(shuō)明書(shū)從組織中提取總RNA：液氮研磨-樣本裂解-抽提-漂洗-洗脫。采用NanoDrop 2000檢測(cè)提取的RNA濃度，隨后采用日本Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（real-time quantitative PCR detecting system，q-PCR）聯(lián)合SYBR Green I法在羅氏480儀器上檢測(cè)CRC組織和癌旁組織中MTDHmRNA、ATG7mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA表達(dá)水平為內(nèi)參。MTDH上游引物：5'-CAGAGTTCCACCTGCTGACA-3'，下游引物：5'-TTCTCAGGCAGGAGTTTGGT-3'；ATG7上游引物：5'-AGCTTGGCTGCTACTTCTGC-3'，下游引物 ：5'-GTCCGGTCTCTGGTTGAATC-3'；GAPDH上游引物：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'，下游引物 ：5'-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3'。兩步法q-PCR反應(yīng)步驟：預(yù)變性95 ℃ 30 s；擴(kuò)增95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)；溶解72℃延伸20 s/35個(gè)循環(huán)；溶解95℃5 s、60℃1 min；降溫50℃30 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。

1.3 觀察指標(biāo)

比較CRC組織及癌旁組織中的MTDHmRNA、ATG7mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，比較不同臨床特征的CRC患者CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對(duì)表達(dá)量；CRC組織/癌旁組織中，MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷結(jié)直腸癌的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析和MTDHmRNA 與ATG7mRNA的相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用ROC曲線評(píng)價(jià)MTDHmRNA與ATG7mRNA對(duì)CRC診斷價(jià)值；CRC患者相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織與癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對(duì)表達(dá)量的比較

CRC組織中MTDHmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（4.57±1.31），顯著高于癌旁組織的（2.36±0.98）；ATG7mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（5.16±0.83），顯著高于癌旁組織的（3.33±1.11），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.99、10.64，P＜0.01）。66例CRC患者中，63例患者CRC組織/癌旁組織的MTDHmRNA比值＞1；61例患者CRC組織/癌旁組織的ATG7mRNA比值＞1。

2.2 MTDHmRNA和ATG7mRNA表達(dá)與CRC患者臨床特征的關(guān)系

不同性別、年齡CRC患者CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和有肝轉(zhuǎn)移CRC患者CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期和無(wú)肝轉(zhuǎn)移的CRC患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.531、3.606、5.833、2.713，P＜0.01）。低分化程度的CRC患者中CRC組織/癌旁組織中的MTDHmRNA和ATG7mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.433、17.463，P＜0.01）。（表1）

2.3 CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷CRC 患者的價(jià)值

CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷CRC患者的AUC為0.934（95% CI：0.890～0.978）、0.900（95% CI：0.839～0.961），分別取MTDHmRNA=3.18和ATG7mRNA=4.01為截?cái)嘀担潇`敏度分別為90.91%和89.39%，特異度分別為86.37%和84.35%。（圖1）

表1 不同臨床特征的CRC患者CRC組織/癌旁組織中MTDH mRNA和ATG7 mRNA表達(dá)情況（n=66）

圖1 CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷CRC的ROC曲線

2.4 CRC組織/癌旁組織中的MTDHmRNA與ATG7mRNA 的相關(guān)性

CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA比值與ATG7mRNA比值呈正相關(guān)（r=0.372，P=0.002）。

3 討論

CRC是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率癌消化系統(tǒng)惡性腫瘤中居第四位，僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌[11]。本病多見(jiàn)于40～70歲人群，血便是CRC患者的最常見(jiàn)癥狀，CRC發(fā)病原因暫不清楚，可能與腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎、血吸蟲(chóng)、高脂飲食、吸煙和遺傳等多種因素有關(guān)，目前主要采取手術(shù)和放射兩種方法。目前，中國(guó)CRC的發(fā)病率及病死率表現(xiàn)為明顯升高趨勢(shì)、地域上東部高西部低、城市高于農(nóng)村等[12-13]。

腫瘤形成的一個(gè)重要原因是癌基因的激活和轉(zhuǎn)錄蛋白的表達(dá)，如MTDH基因激活誘導(dǎo)CRC增殖。早期MTDH基因編碼的蛋白被認(rèn)為是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行黏附的單向跨膜蛋白。然而隨后的研究表明MTDH基因編碼的蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核而非細(xì)胞膜，表明其并非單向跨膜蛋白[14]。近年來(lái)，研究顯示MTDH基因在多種惡性腫瘤中通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移和治療藥物抵抗等作用[3,15]。MTDH的mRNA相對(duì)表達(dá)量在子宮內(nèi)膜的正常組織中高于不典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌，且其相對(duì)表達(dá)量與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、TNM分期、組織學(xué)分化程度和預(yù)后不良呈明顯的正相關(guān)性[16]。本研究結(jié)果顯示，CRC患者的CRC組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對(duì)表達(dá)量，均顯著高于癌旁組織（P＜0.01）。TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者中，CRC組織/癌旁組織中的MTDHmRNA和ATG7mRNA的相對(duì)表達(dá)量，均顯著高于Ⅰ～Ⅱ期和無(wú)肝轉(zhuǎn)移的CRC患者（P＜0.01）。低分化程度的CRC患者中，CRC組織/癌旁組織中的MTDHmRNA和ATG7mRNA相對(duì)表達(dá)量最高（P＜0.01）。CRC組織/癌旁組織中MTDHmRNA和ATG7mRNA診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積分別為0.934和0.900，其靈敏度分別為90.91%和89.39，特異度分別為86.37%和84.35%，結(jié)果表明MTDH基因可能成為CRC診斷的新腫瘤標(biāo)志物，在CRC的分子靶向治療中具有重要意義。

自噬是真核細(xì)胞通過(guò)溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器等大分子物質(zhì)的生命過(guò)程，完成細(xì)胞代謝過(guò)程，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，也能對(duì)不良刺激進(jìn)行應(yīng)答實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)，同時(shí)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有多重作用[17]。ATG7基因編碼的蛋白是參與自噬過(guò)程的重要蛋白能結(jié)合并調(diào)控p53蛋白來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展[18]。研究表明，ATG7基因與CRC、肺癌、肝癌等多種腫瘤異常增殖相關(guān)。當(dāng)ATG7基因過(guò)表達(dá)時(shí)CRC的增殖能力明顯增強(qiáng)[8]；小鼠模型中，ATG7基因缺失顯著降低肺癌癌變的成瘤能力；敲除ATG7基因能夠抑制腸上皮腫瘤的發(fā)生發(fā)展、促進(jìn)機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)[19]。ATG7基因介導(dǎo)的細(xì)胞自噬還能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，例如肝癌細(xì)胞中ATG7基因通過(guò)促進(jìn)自噬發(fā)生，增強(qiáng)索拉非等化療藥物的耐藥性[20-21]。MTDHmRNA比值與ATG7mRNA比值呈正相關(guān)，表明在CRC中MTDH的過(guò)度活化促進(jìn)了自噬的發(fā)生，MTDH有望成為CRC診斷和治療的新的靶標(biāo)分子，但具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，MTDHmRNA和ATG7mRNA在CRC中表達(dá)增高，此次研究為MTDH和ATG7在CRC中的意義提供了新的見(jiàn)解，提示可以成為發(fā)現(xiàn)CRC的較好指標(biāo)。