Rac1蛋白在人卵巢漿液性腺癌組織中的表達及其對卵巢癌細胞SKOV3遷移能力的影響△

蘇夢亞，黃平，齊冰麗，姚海榮，張紀妍

滄州市中心醫院婦一科，河北 滄州 061000

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，病死率高，早期癥狀不明顯，且無可靠的篩查方法，多數患者出現癥狀時往往已進展至晚期，且已發生腹腔種植與轉移，病死率較高[1]。研究發現，世界范圍內卵巢癌的發病率呈上升趨勢，而且長期化療使卵巢癌患者的精神處于焦慮、抑郁的狀態，因此，有效的治療方法成為高發病率、高轉移率卵巢癌患者的迫切需要[2]。本研究通過體外實驗觀察Rac1蛋白在卵巢癌組織中的表達情況，探索其對卵巢癌惡性生物學行為的影響，從而為探索新的卵巢癌治療方法提供理論依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年2月至2017年12月滄州市中心醫院收治的90例卵巢腫瘤患者。納入標準[3]：初診為卵巢漿液性腺癌和卵巢良性漿液性囊腺瘤；對治療方案知情且簽署治療知情同意書。排除標準：合并代謝功能障礙；合并心血管、腦血管、肝、腎等其他系統疾病；合并精神類疾病；妊娠期或哺乳期婦女；身體條件不允許接受化療[4]。90例卵巢腫瘤患者的年齡為28～60歲，平均年齡為（43.39±7.54）歲；病程為2～9年，平均病程為（5.1±1.2）年。收集90例卵巢腫瘤患者的卵巢腫瘤組織標本，包括卵巢漿液性腺癌組織標本59例和卵巢良性漿液性囊腺瘤組織標本31例；同時，收集同期健康體檢者的正常卵巢組織標本35例。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質印跡法（Western blot）檢測Rac1蛋白表達 采用酶標儀檢測蛋白樣品濃度，取適量蛋白，加入溴酚藍與RIPA裂解液，煮沸7 min，將蛋白樣品徹底變性，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳后，5%脫脂奶粉封閉90 min后，采用Western blot檢測目標蛋白條帶，根據條帶灰度顯示情況判斷Rac1蛋白的相對表達量[5]。

1.2.2 構建穩定轉染細胞株 設計siRNA靶序列，接入pSR-GFP/neo質粒，通過G418篩選穩定轉染的細胞，驗證Rac1表達缺失的細胞（構建的目的細胞株SKOⅤ3-Rac1i）[6]。采用iRNA干擾技術沉默內源性Rac1的表達，將設計合成的3條Rac1干擾片段分別與空質粒載體連接合成重組質粒，檢測重組載體質粒pSR-GFP/neo-Rac1i是否構建成功。將構建成功的3條Rac1干擾質粒分別轉染入SKOⅤ3細胞，72 h后提取總蛋白，Western blot檢測各載體對Rac1蛋白的抑制率，檢測3個干擾片段的干擾效果，選取載體抑制效果較好的片段質粒作為SKOⅤ3-Rac1i用于后續實驗。

1.2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 將收集的全部細胞分為SKOⅤ3-Rac1i細胞組和野生型SKOⅤ3組，取處于對數生長期的細胞種植于6孔板內，用含絲裂霉素C的培養基培養細胞，然后于孔板底部進行劃痕，并置入孵箱進行下一步培養。在固定范圍內取樣拍照，并用直尺測量同一部位的劃痕寬度，觀察不同時間點（0、24、48、72 h）的細胞遷移能力[7]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和重復測量方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中Rac1蛋白的表達情況

卵巢漿液性腺癌組織中Rac1蛋白的相對表達量為（0.89±0.16），卵巢良性漿液性囊腺瘤組織中Rac1蛋白的相對表達量為（0.69±0.14），卵巢正常組織中Rac1蛋白的相對表達量為（0.72±0.13），組間比較，差異有統計學意義（F=24.666，P＜0.01）。卵巢漿液性腺癌組織中Rac1蛋白的相對表達量明顯高于卵巢良性漿液性囊腺瘤組織和卵巢正常組織，差異均有統計學意義（t=5.875、5.326，P＜0.01）；卵巢良性漿液性囊腺瘤組織和卵巢正常組織中Rac1蛋白的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 構建Rac1缺失性表達細胞株

與陰性質粒比較，1號干擾片段質粒對Rac1蛋白的抑制率為（12.59±2.65）%，2號干擾片段質粒對Rac1蛋白的抑制率為（56.48±6.25）%，3號干擾片段質粒對Rac1蛋白的抑制率為（73.68±5.29）%。其中，3號干擾片段質粒的抑制效果較好，作為SKOⅤ3-Rac1i用于后續實驗。

2.3 SKOV3-Rac1i細胞遷移能力的比較

劃痕實驗結果顯示，不同時間點SKOⅤ3-Rac1i細胞組和野生型SKOⅤ3組SKOⅤ3-Rac1i細胞的遷移能力比較，差異有統計學意義（F時間=5.291，P時間＜0.05）；SKOⅤ3-Rac1i細胞組和野生型SKOⅤ3組SKOⅤ3-Rac1i細胞的遷移能力比較，差異有統計學意義（F組間=4.089，P組間＜0.05）；SKOⅤ3-Rac1i細胞組和野生型SKOⅤ3組SKOⅤ3-Rac1i細胞的遷移能力在組間和時間上存在交互作用（F交互=6.131，P交互＜0.05）。SKOⅤ3-Rac1i細胞組SKOⅤ3-Rac1i細胞24、28、72 h的遷移能力均低于野生型SKOⅤ3組，差異均有統計學意義（t=10.258、11.665、11.843，P＜0.05）。（表1）

表1 兩組SKOⅤ3-Rac1i細胞不同時間點的遷移能力（±s）

表1 兩組SKOⅤ3-Rac1i細胞不同時間點的遷移能力（±s）

組別野生型S K OⅤ3組S K OⅤ3-R a c 1 i細胞組0.3 8±0.0 2 0.1 8±0.0 2 0.5 8±0.1 0 0.3 5±0.0 3 0.8 1±0.2 0 0.5 2±0.1 2 2 4 h 4 8 h 7 2 h

3 討論

卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的一類疾病，缺乏有效的早期診斷手段是其發病率和病死率較高的重要原因。隨著RNA干擾技術的出現和發展，對卵巢癌抑癌基因和細胞免疫因素的研究對卵巢癌的臨床診斷和治療起著重要的指導作用[8-10]。卵巢癌的發展與某些蛋白的表達和基因的異常等密切相關，結合臨床實踐探究這些因子在卵巢惡性腫瘤中的表達情況及其與卵巢癌惡性生物學行為的關系逐漸成為該領域的研究熱點，以期為卵巢癌的臨床診治提供理論依據[11-12]。

卵巢癌起病隱匿，易發生擴散。轉移、侵襲是卵巢癌重要的生物學特征，而腫瘤細胞遷移的啟動與細胞伸出偽足并與周圍基質黏附有關，而Rac1參與調控細胞板狀偽足的形成，進而調控卵巢癌細胞的遷移和侵襲。在各種致癌因素的作用下，卵巢局部組織的細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，導致其異常增生。卵巢癌細胞的遷移是由偽足的形成并與基質的黏附而啟動的。Rac1蛋白在信號傳導過程中具有重要功能。Rac1基因的轉錄產物在惡性組織中的表達，轉錄過程中通過選擇性剪接Rac1b基因轉錄產物可增加一個外顯子，這是一種持續的活性突變體，對于卵巢癌細胞的增殖有很大影響[13]。本研究探究了Rac1蛋白表達對卵巢癌細胞SKOⅤ3遷移能力的影響，結果顯示，卵巢漿液性腺癌組織中Rac1蛋白的表達最活躍；下調SKOⅤ3-Rac1i的表達時，SKOⅤ3-Rac1i細胞的遷移能力下降（P＜0.05）。由于腫瘤的發生發展是一個多因素、多基因參與的生物學過程，單純的某一腫瘤基因被阻斷并不可能達到抑制腫瘤生長的目的，而利用RNAi可以針對同一基因家族保守序列的dsRNA同時抑制多個相關基因的表達。RNAi可使特定基因沉默，具有較強的干擾活力，是靶向基因治療的有效手段，對推動腫瘤基因治療的發展具有重要意義。本研究結果顯示，3號干擾片段質粒對Rac1蛋白的抑制率較高，載體抑制效果較好，被作為SKOⅤ3-Rac1i；與野生型SKOⅤ3組相比，SKOⅤ3-Rac1i細胞組的遷移速度明顯下降（P＜0.05）。提示下調Rac1表達后，SKOⅤ3細胞的遷移能力受到抑制。腫瘤細胞的侵襲方式包括間充質移動、變形蟲樣移動、集團移動[14]，這3種運動方式均需要腫瘤細胞內在的改變和外在因素的觸發從而獲得運動能力。Rac1是一類重要的信號轉導分子，其過表達與卵巢癌的進展有關，可通過調節細胞周期從而促進卵巢癌細胞的增殖。激活的Rac1亦可通過調節MMP及其組織特異性抑制因子的表達，促進腫瘤細胞的侵襲。本研究發現Rac1蛋白在卵巢癌組織中呈高表達，說明Rac1蛋白過表達與卵巢癌的發生、發展密切相關。

有研究發現，肌動蛋白的表達可負調控Rac的激活，Rac1可作為肌動蛋白的靶點從而調控腫瘤細胞的遷移和增殖[15]。Tiaml蛋白可介導Rac1從無活性的鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）轉換為有活性的鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）。因此，Tiam1/Rac1信號在腫瘤細胞的侵襲和轉移中具有重要作用。惡性腫瘤組織中Rac1的表達水平較高，且隨著腫瘤惡化程度的增加，Rac1的表達呈增高趨勢。Rac1的表達可作為反映卵巢癌進展和惡性程度的參考指標，具有預后意義。

綜上所述，Rac1蛋白與卵巢癌的發生密切相關，其在卵巢癌中呈高表達，且其表達的缺失對于預測卵巢癌細胞的遷移能力有顯著的臨床價值。但本研究存在不足之處，如納入的樣本量不足，因此，在后續的研究中將進一步補充臨床資料、擴大樣本量，深入研究Rac1蛋白在卵巢癌發生發展中的作用，以進一步闡明卵巢癌發生、發展的潛在分子機制。