RACK1、HSF1、E-cadherin 在宮頸癌中的表達及與臨床特征、預后的關系

胡娟，張洪波，劉榮華

江漢大學附屬醫院/武漢市第六醫院1婦產科，2檢驗科，武漢 430014

3華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科，武漢 430030

宮頸癌為女性生殖系統常見的惡性腫瘤，以陰道出血、陰道排液為主要癥狀，近年來隨著腫瘤篩查的普及及治療技術的進步，其發生率及病死率已有所下降，但仍有較多患者死于腫瘤復發及轉移[1]。因此臨床對于宮頸癌侵襲轉移機制的研究及預后影響因素的探討有重要價值。分子生物學指標為近年來宮頸癌預后研究的重點，不僅能夠預測臨床結局，且可利于療效評估及靶向治療[2]。激活的激酶C受體1（receptor for activated C kinase 1，RACK1）可與多種細胞內信號分子相互作用，參與細胞生長、分化等過程，在多種惡性腫瘤中高表達[3]。熱休克轉錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）為機體重要的轉錄因子，能夠調控腫瘤間質細胞生成，促進惡性腫瘤發生[4]。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）作為一種鈣離子依賴性跨膜糖蛋白，可維持上皮細胞間黏附，其表達下調是引起腫瘤發生、侵襲和轉移的主要誘因之一[5]。目前臨床上缺乏宮頸癌聯合檢測RACK1、HSF1、E-cadherin表達的研究報道，本研究旨在探討其在宮頸癌發生中的機制，并分析其與臨床特征及預后的關系，為此類患者尋找新的防治靶點，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年6月至2013年1月武漢市第六醫院收治的宮頸癌患者的病歷資料。納入標準：①均經病理組織活檢證實為宮頸癌；②病歷資料完整。排除標準：①接受新輔助放化療；②全子宮切除史；③全身系統明顯病變。根據納入和排除標準，共納入宮頸癌患者68例，年齡31～73歲，平均（46.82±7.84）歲；病理類型：腺癌55例，鱗狀細胞癌13例；臨床分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期44例；分化程度：低分化32例，中分化29例，高分化7例；有淋巴結轉移50例，無淋巴結轉移18例。選取同期28例宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者，年齡30～70歲，平均（44.93±8.82）歲。另選取23例因子宮肌瘤行全子宮切除術患者，年齡33～70歲，平均（45.90±9.17）歲。3組受試者的年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。分別選取宮頸癌患者、CIN患者、全子宮切除患者的宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織。

1.2 主要試劑和儀器

鼠抗人RACK1單克隆抗體、鼠抗人HSF1單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體均購自上海田源生物技術有限公司；蘇木精購自上?？婆d商貿有限公司；中性樹脂膠購自北京鑫鼎鵬飛科技發展有限公司；免疫組織化學檢測試劑盒購自上海戶實醫藥科技有限公司；濃縮型二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自紹興迪申生物技術有限公司。A550石蠟切片機購自上海源葉生物科技有限公司；GD（J）W-010低溫箱購自西安恒茂動力科技有限公司；GZX-DH.400-BS-Ⅱ電熱恒溫培育箱購自西化儀（北京）科技有限公司；HH.W21電熱恒溫水箱購自北京同德創業科技有限公司；ND11-DYY-8C電泳儀購自上海壘固儀器有限公司；9700聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀購自濟南鑫貝西生物技術有限公司；LJ-CLP03光學顯微鏡購自北京科譽興業科技發展有限公司。

1.3 檢測方法

收集相關宮頸組織，放置于液氮中并轉移至-80℃低溫箱中待用。選用免疫組織化學染色法進行測定，石蠟標本進行4 μm層厚連續切片，放置于70℃烤箱中烘烤1.5 h。將切片進行二甲苯脫蠟，并予以100%、90%、80%、70%梯度酒精水化。于蒸餾水中漂洗3 min，以PBS沖洗3次。于切片中加入3% H2O2去離子水孵育10 min，抑制內源性過氧化物酶活性。以PBS沖洗3次，參照各抗體要求進行相應的熱抗原修復，PBS沖洗3次。于切片中加入適當比例稀釋的一抗（RACK1抗體稀釋度為 1∶100，HSF1抗體稀釋度為 1∶50，E-cadherin抗體稀釋度為1∶100），放置于4℃冰箱中過夜。以PBS沖洗3次，加入通用性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）多聚體，室溫環境下放置30 min。以PBS沖洗3次，于每個切片中加入2滴剛配制的DAB溶液進行顯色，在顯微鏡下調控顯色時間至陽性物質出現棕黃色反應時，以自來水沖洗并終止顯色反應。取蘇木素進行復染，以自來水再次返藍，梯度酒精以脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂進行封片。

1.4 結果判定

在高倍鏡（400倍）下隨機選擇5個視野，單個視野觀察200個以上細胞，RACK1陽性表達在細胞質、細胞核，HSF1陽性表達在細胞核，E-cadherin陽性表達在細胞核、細胞質。按染色強度及陽性細胞所占比例判定結果。陽性細胞所占比例：51%～100%計為3分，26%～50%計為2分，10%～25%計為1分，＜10%計為0分。染色強度：棕褐色計為3分，棕黃色計為2分，淺黃色計為1分，無色計為0分。二者分數乘積≥3分即為陽性[6]。

1.5 隨訪

宮頸癌患者均以門診復診、電話等方式進行為期5年的隨訪，明確患者生存情況，統計5年生存率，其中失訪1例，隨訪率為98.53%。

1.6 統計學分析

采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用方差分析；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或連續矯正法；采用Log-rank檢驗分析比較生存情況；采用Cox風險比例模型進行多因素分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同宮頸組織中RACK1、HSF1、cadherin陽性表達情況的比較

宮頸癌組織中RACK1、HSF1的陽性表達率均高于CIN組織及正常宮頸組織，E-cadherin的陽性表達率分別低于CIN組織及正常宮頸組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

圖1 免疫組織化學法檢測宮頸癌、CIN、正常宮頸組織中RACK1、HSF1、E-cadherin的表達情況（SP染色，×400）

表1 不同宮頸組織中RACK1、HSF1、E-cadherin蛋白陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征的宮頸癌患者宮頸癌組織中RACK1、HSF1、E-cadherin陽性表達情況的比較

臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤、低分化、有淋巴結轉移的宮頸癌患者的宮頸癌組織中RACK1陽性表達率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、淺肌層浸潤、中～高分化、無淋巴結轉移宮頸癌患者的宮頸癌組織，差異均有統計學意義（χ2=9.157、7.955、3.961、14.371，P＜0.05）；臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤、低分化、有淋巴結轉移的宮頸癌患者的宮頸癌組織中HSF1陽性表達率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、淺肌層浸潤、中～高分化、無淋巴結轉移宮頸癌患者的宮頸癌組織，差異均有統計學意義（χ2=10.126、4.983、5.884、11.730，P＜0.05）；臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤、低分化、有淋巴結轉移的宮頸癌患者的宮頸癌組織中E-cadherin陽性表達率分別低于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、淺肌層浸潤、中～高分化、無淋巴結轉移宮頸癌患者的宮頸癌組織，差異均有統計學意義（χ2=13.421、21.454、37.370、14.985，P＜0.05）；不同年齡及病理類型宮頸癌患者的宮頸癌組織中RACK1、HSF1、E-cadherin陽性表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的宮頸癌患者宮頸癌組織中RACK1、HSF1、E-cadherin的陽性表達情況

2.3 宮頸癌預后影響因素的單因素分析

不同年齡、病理類型、臨床分期、肌層浸潤、分化程度、淋巴結轉移、RACK1、HSF1、E-cadherin表達的宮頸癌患者的生存情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

2.4 宮頸癌預后影響因素的多因素分析

將2.3中分析差異有統計學意義的因素納入多因素Cox比例風險模型，結果顯示，年齡＞50歲、腺癌、臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤、低分化、有淋巴結轉移、RACK1陽性表達、HSF1陽性表達均是影響宮頸癌預后的危險因素，E-cadherin陽性表達是宮頸癌預后的保護因素。（表4）

3 討論

宮頸癌是婦科常見腫瘤，目前其發病率呈年輕化趨勢，危及患者的生命安全。早期發現高危人群，并開展針對性的重點預防工作能夠一定程度降低其發生率與病死率[7]。宮頸癌的發病機制目前尚無準確定論，準確評估其生物學行為與預后情況，對臨床治療的指導及生活質量的改善有重要價值[8]。國外研究認為，細胞癌變為多因素、多階段過程，與系列基因異常表達相關[9]。

表3 宮頸癌預后影響因素的單因素分析（n=68）

表4 宮頸癌預后影響因素的多因素分析

RACK1的結構特殊，能夠與人類免疫缺陷病毒1型基因、蛋白激酶C等結合，參與細胞內多種信號的轉導通路，調控腫瘤細胞的生長[10]。同時其作為核糖體的重要成分，可調節蛋白質產生。既往研究發現，RACK1于新生血管中高度表達，可調節腫瘤細胞對凋亡的抵抗，利于凋亡基因的降解及活化[11-12]。動物試驗發現，RACK1過表達組裸鼠腫瘤生長速度明顯快于未經處理的裸鼠[13]。本研究顯示，宮頸癌組織中RACK1陽性表達率高于CIN組織，且其高表達與臨床分期、肌層浸潤、分化程度、淋巴結轉移有關，與臨床研究報道[14]相似，說明其可一定程度反映宮頸癌的分化程度與侵襲、轉移等惡性特征。經Cox回歸分析顯示RACK1陽性表達是影響宮頸癌患者預后的獨立危險因素，可作為預后判斷的觀察指標。

HSF1為熱休克反應中的主要調節因子，可維持細胞內平衡，并參與機體老齡化、癌癥等生理病理反應[15]。近年來，相關研究發現其不僅調節腫瘤細胞存活基因，且可誘導侵襲轉移、細胞增殖[16]。余少敏等[17]研究認為，蛋白質翻譯率和HSF1轉錄激活聯系緊密，說明其可通過調控惡性代謝程序以促進腫瘤細胞蛋白生成，促進腫瘤進展。宮頸癌體外實驗顯示，通過影響RNA抑制HSF1表達，可降低熱休克反應通路的相關熱休克蛋白，促進腫瘤細胞的凋亡[18]。本研究發現，HSF1在正常宮頸組織、CIN組織及宮頸癌組織中的陽性表達率逐步升高，提示HSF1可能參與宮頸癌的發生發展，此外HSF1在高臨床分期、深肌層浸潤、低分化、有淋巴結轉移宮頸癌患者宮頸癌組織中的陽性表達率高于低臨床分期、淺肌層浸潤、中高分化及無淋巴結轉移患者，說明HSF1可能與宮頸癌浸潤轉移及惡性程度有關，有望成為評估其進展程度的新型標志物。預后分析顯示，HSF1表達與宮頸癌患者預后有關，其高表達可提示預后不良，由此可推測HSF1的高表達可能參與宮頸癌癌基因的激活，影響預后。

E-cadherin作為一種抑癌基因，可于正常上皮細胞膜中穩定表達，系列因素可導致其表達減少或者缺失，引起復合體解散，并激活多條信號途徑，減弱細胞間黏附能力，從而促進腫瘤的浸潤與侵襲[19]。臨床研究報道，多種腫瘤組織中的E-cadherin陽性表達率均明顯低于正常組織，并認為E-cadherin的表達下降或者缺失能夠改變細胞黏附活動性及動力學，影響上皮細胞連接，進而參與腫瘤的發生[20-21]。本研究發現，E-cadherin在宮頸癌組織中呈低表達，其在臨床分期為Ⅲ期、深肌層浸潤、低分化、有淋巴結轉移宮頸癌患者的宮頸癌組織中的陽性表達率更低，說明通過監測E-cadherin表達情況不僅能夠利于宮頸癌的篩查及診斷，且可反映癌變惡性程度。同時根據E-cadherin表達分析患者預后可見，其陽性表達者預后相對較好，是宮頸癌患者預后的保護因素。

綜上所述，RACK1、HSF1、E-cadherin可作為宮頸癌患者臨床特征與預后的參考指標。但本研究樣本量較少，存在一定的抽樣誤差，有待更多累計研究考評。