原鈣黏蛋白10對胃癌順鉑化療敏感性的影響及作用機制初探

郭錦濤，李俊，岳德亮

信陽市中心醫院普通外科，河南 信陽 464000

胃癌是一種上消化道惡性腫瘤，發病率和病死率均居惡性腫瘤前列，隨著生活節奏的加快及飲食結構的轉變，胃癌發病率逐年升高[1]，嚴重威脅患者的生命健康。目前，臨床常采用規范化手術、放化療等綜合治療方案治療胃癌，但部分中晚期患者仍可發生遠處轉移，預后不良[2]。腫瘤細胞多藥耐藥是預后不良的重要因素，順鉑作為胃癌化療的一線藥物，其耐藥性受到臨床廣泛關注。原鈣黏蛋白10（procadherin 10，PCDH10）屬于鈣黏蛋白超家族亞群成員，多項研究表明，PCDH10是一種腫瘤細胞抑制基因[3-5]，在舌鱗狀細胞癌、胰腺癌、乳腺癌等腫瘤細胞中均呈異常低表達，參與腫瘤發生發展進程。目前，關于PCDH10對順鉑化療敏感性影響及機制的研究較少。多種惡性腫瘤中均存在磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路異常激活，且該通路存在一個重要的下游信號分子，即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR），而p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6）是MTOR的直接底物，該通路在促進腫瘤放化療抵抗上具有重要作用[6-7]，由此推測，PCDH10可通過調控PI3K/AKT/MTOR/p70S6通路參與胃癌對順鉑的耐藥進程。為驗證該猜想，本研究通過建立過表達PCDH10的人胃癌BGC823細胞株，探討PCDH10對順鉑化療敏感性的影響及作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人胃癌BGC823細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，pcDNA3.1+PCDH10質粒、pcDNA3.1+空質粒均購自云舟生物科技（廣州）有限公司。RPMI-1640培養基、胎牛血清、lipofectamineTM2000試劑盒均購自美國Amresco公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自美國Sigma公司，熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒均購自日本TCI公司，lipofectamineTM2000試劑盒購自日本Takara公司。NIB900-FL型倒置熒光顯微鏡購自廣州市明慧科技有限公司，7500 Real-Time定量PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific-CN公司，Spectra Max iD5酶標儀購自美國molecular devices公司，PE2400電泳儀、GelDOC2000型凝膠成像分析系統均購自美國Bio-Rad中國公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及轉染 人胃癌BGC823細胞株接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，37℃恒溫、恒濕箱，5% CO2環境中孵育培養。取對數期細胞接種于24孔板，細胞長滿75%瓶底面積時，更換為無雙抗的完全培養基。嚴格按照LipofectamineTM2000脂質體說明書進行轉染，將pcDNA3.1+PCDH10質粒、pcDNA3.1+空質粒轉染至人胃癌BGC823細胞株，分別作為轉染組、空載組，轉染36 h后采用熒光顯微鏡觀察轉染效果，將未作任何處理的BGC823細胞株作為空白組。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測PCDH10mRNA 的相對表達量 收集轉染36 h后的轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞，Trizol法裂解提取總RNA，取1 μg經逆轉錄試劑盒逆轉錄獲取互補DNA（complementary DNA，cDNA）。按照Takara SYBR Green熒光定量試劑盒要求進行反轉錄，反應條件：94℃ 10 min，1個循環；52℃ 28 s，72℃28 s，共30個循環，以U6為內參，共22個循環，最后70℃延伸2 min。PCDH10正向引物：5'-TTGACCAGTTGCAGCATGAACG-3'，反向引物 ：5'-GTGAACCTGACTTAGGCACGCC-3'；U6正向引物：5'-TAGCCAGTTGCAGCACCTTATA-3'，反向引物：5'-GGTAGAGACGCCGTGCGCATAC-3'。實驗重復3次取平均值。

1.2.3 蛋白質印記法（Western blot）檢測PCDH10蛋白的相對表達量 按照蛋白提取試劑盒要求獲取轉染36 h后的轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞總蛋白，BCA法定量，常規變性后經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，經電轉儀轉至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入一抗（稀釋濃度為1∶500）、二抗（稀釋濃度為1∶1000）孵育1 h，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，以β-actin為內參，采用Fusion軟件計算目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次取平均值。

1.2.4 噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細胞增殖情況 取穩定轉染的轉染組、空載組、空白組人胃癌BGC823細胞，重新調整細胞密度，以1.0×104/ml接種于96孔板，每孔200 μl，每組設置5個復孔。培養至24、48、72 h時，每孔加入20 μl新制備MTT溶液（濃度為5 μg/μl），繼續培養4 h后丟棄上層培養液，每孔加入150 μl的DMSO溶液，震蕩均勻后采用酶標儀測定570 nm波長處光密度（optical density，OD）值。實驗重復3次取平均值。

1.2.5 劃痕試驗檢測細胞遷移能力 取穩定轉染的轉染組、空載組及空白組人胃癌BGC823細胞，胰蛋白酶消化、重懸；采用無血清培養基洗滌2次后，以2.0×104/ml接種于6孔板，孵育過夜，細胞鋪滿底壁后丟棄培養基；采用2 μl無菌槍頭劃痕，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）輕吹去除劃下細胞，加入完全培養基孵育24 h后取樣、拍照。細胞遷移率（%）=（初始劃痕寬度-24 h后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell小室檢測細胞侵襲能力 收集穩定轉染的轉染組、空載組及空白組人胃癌BGC823細胞，加入無血清培養基培養12 h，調整各組細胞濃度為2.0×105/ml。于孔徑8 μm、24孔的Transwell小室的上室中加入200 μl各組細胞懸液，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，置于孵箱中孵育24 h后取出小室。取少量懸液置于計數板中，于顯微鏡下觀察穿過濾膜進入下室下腔的細胞數量。

1.2.7 PCDH10對不同濃度順鉑的敏感性 取穩定轉染的轉染組、空載組及空白組人胃癌BGC823細胞，胰蛋白酶消化，重懸，以5.0×103/孔接種于96孔板，每組設置5個復孔。依次分別向轉染組、空載組及空白組細胞中加入順鉑，使終濃度分別為0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μg/ml。采用 MTT法測定570 nm處OD值，細胞存活率（%）=（各濃度OD值-空白組OD值）（/0 μg/ml OD值-空白組OD值）。根據曲線計算順鉑對BGC823細胞的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

1.2.8 實時熒光定量PCR檢測PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA 的相對表達量 取部分穩定轉染的轉染組、空白組人胃癌BGC823細胞，胰蛋白酶消化，重懸，以5.0×103/孔接種于96孔板。分別加入IC50濃度的順鉑溶液，即濃度為4.000 μg/ml的順鉑溶液，分別作為轉染+順鉑組、順鉑組。培養48 h后，胰蛋白酶消化，重新收集穩定轉染的轉染組、空白組細胞及轉染+順鉑組、順鉑組細胞，采用實時定量RT-PCR法測定4組細胞中PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA的相對表達量，以β-actin為內參，重復3次取Ct平均值，以2-△△CT計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.9 Western blot檢 測PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白的相對表達量 重新收集穩定轉染的轉染組、空白組細胞、順鉑組、轉染+順鉑組細胞，PBS沖洗后，加入裂解液冰上裂解35 min，4℃以11 000 r/min離心25 min，取上清；每孔加入200 μl的BCA混合液，經SDS-PAGE電泳分離，轉膜后封閉1.5 h，加入一抗、二抗孵育，取出條帶漂洗，避光顯影，以β-actin為內參采用Fusion軟件計算各條帶灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCDH10mRNA及PCDH10蛋白相對表達量的比較

轉染組細胞PCDH10mRNA及PCDH10蛋白的相對表達量，均高于空載組和空白組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；空白組和空載組PCDH10mRNA及PCDH10蛋白的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.2 增殖能力的比較

穩定轉染轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞重新接種并培養24、48、72 h時，轉染組細胞OD值均低于空載組和空白組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；空白組和空載組細胞OD值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表2 轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞PCDH10 mRNA及PCDH10蛋白相對表達量的比較（±s）

表2 轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞PCDH10 mRNA及PCDH10蛋白相對表達量的比較（±s）

注：a與空白組細胞比較，P＜0.05；b與空載組細胞比較，P＜0.05

組別空白組空載組轉染組F值P值0.3 1±0.0 6 0.3 4±0.0 5 0.9 1±0.0 9 a b 1 2 0.7 3 9 0.0 0 0 0.2 8±0.0 2 0.3 0±0.0 4 0.8 8±0.1 0 a b 1 4 5.1 6 7 0.0 0 0 P C D H 1 0 m R N A P C D H 1 0蛋白

表3 轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞增殖能力比較（±s）

表3 轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞增殖能力比較（±s）

注：a與空白組細胞比較，P＜0.05；b與空載組細胞比較，P＜0.05

空載組0.3 0 8±0.0 2 1 0.5 6 0±0.0 5 9 0.8 0 3±0.0 7 8時間2 4 h 4 8 h 7 2 h空白組0.3 0 1±0.0 1 9 0.5 5 7±0.0 6 1 0.7 9 6±0.0 8 1轉染組0.1 5 6±0.0 1 3 a b 0.2 6 3±0.0 3 1 a b 0.4 0 9±0.0 4 9 a b F值1 1 3.7 4 4 5 3.4 9 0 5 0.6 8 7 P值0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0

2.3 遷移和侵襲能力的比較

培養24 h時，轉染組細胞遷移率和穿膜細胞數均低于空載組、空白組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；空載組和空白組細胞遷移率和穿膜細胞數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表4）

表4 轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞遷移率和穿膜細胞數的比較（±s）

表4 轉染組、空載組和空白組人胃癌BGC823細胞遷移率和穿膜細胞數的比較（±s）

注：a與空白組細胞比較，P＜0.05；b與空載組細胞比較，P＜0.05

組別空白組空載組轉染組F值P值8 1.0 2±5.9 4 8 3.1 1±5.2 6 5 3.9 7±4.5 8 a b 4 7.2 2 0 0.0 0 0 1 1 4.8 6±1 8.9 0 1 1 9.3 3±1 9.0 4 4 1.0 6±5.9 1 a b 3 8.4 0 3 0.0 0 0遷移率（%）穿膜細胞數

2.4 不同順鉑濃度細胞存活率及IC50的比較

順鉑濃度分別為 0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μg/ml時，轉染組細胞存活率均低于空載組和空白組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；空載組和空白組細胞存活率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表5）。轉染組順鉑對細胞的IC50值（1.52±0.29）μg/ml，均低于空白組（4.31±0.40）μg/ml和空載組（3.98±0.37）μg/ml，差異均有統計學意義（P＜0.05）；空白組與空載組順鉑對細胞的IC50值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表5 不同順鉑濃度人胃癌BGC823細胞存活率比較（%，±s）

表5 不同順鉑濃度人胃癌BGC823細胞存活率比較（%，±s）

注：a與空白組細胞比較，P＜0.05；b與空載組細胞比較，P＜0.05

順鉑濃度（μ g/m l）0.5 0 0 1.0 0 0 2.0 0 0 4.0 0 0 8.0 0 0空白組9 1.8 5±4.1 3 8 2.5 6±4.8 1 6 5.6 3±5.2 4 5 2.8 9±4.0 1 3 2.0 5±3.5 4空載組8 9.1 3±5.5 2 8 0.2 4±4.9 5 6 3.7 0±5.1 0 5 0.5 2±3.9 5 3 0.3 0±3.6 7轉染組7 7.5 7±5.9 4 a b 6 3.3 0±5.2 9 a b 3 8.5 4±4.0 2 a b 2 1.6 9±2.5 0 a b 9.5 3±1.0 8 a b F值1 0.4 1 4 2 1.9 2 8 4 9.2 1 2 1 1 9.3 0 5 8 6.6 5 0 P值0.0 0 2 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0

2.5 PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA相對表達量的比較

各組細胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA相對表達量的組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中轉染組、順鉑組、轉染+順鉑組細胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相對表達量均低于空白組細胞，轉染+順鉑組細胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相對表達量均低于轉染組和順鉑組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；轉染組和空白組細胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。各組細胞AKT mRNA的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表6）

表6 各組細胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6 mRNA相對表達量的比較（±s）

表6 各組細胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6 mRNA相對表達量的比較（±s）

注：a與空白組細胞比較，P＜0.05；b與轉染組細胞比較，P＜0.05；c與順鉑組細胞比較，P＜0.05

P I 3 K m R N A 0.9 1±0.1 0 0.5 5±0.0 9 a 0.5 7±0.0 8 a 0.2 9±0.0 5 a b c 4 7.9 0 1 0.0 0 0 0.8 2±0.0 8 0.8 0±0.0 7 0.8 1±0.0 9 0.7 9±0.1 0 0.1 1 3 0.9 5 1 0.8 6±0.0 8 0.5 1±0.0 7 a 0.5 6±0.0 9 a 0.2 9±0.0 5 a b c 5 0.3 2 0 0.0 0 0 0.8 4±0.0 9 0.5 6±0.0 7 a 0.5 9±0.0 6 a 0.2 7±0.0 4 a b c 5 9.8 1 7 0.0 0 0空白組轉染組順鉑組轉染+順鉑組F值P值A K T m R N A M T O R m R N A p 7 0 S 6 m R N A組別

2.6 PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相對表達量的比較

各組細胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相對表達量的組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中轉染組、順鉑組、轉染+順鉑組細胞PI3K、MTOR、p70S6的相對表達量和pAKT/AKT均低于空白組細胞，轉染+順鉑組細胞PI3K、MTOR、p70S6的相對表達量和pAKT/AKT均低于轉染組和順鉑組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；轉染組和空白組細胞PI3K、MTOR、p70S6的相對表達量和pAKT/AKT比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表7）

表7 各組細胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相對表達量的比較（±s）

表7 各組細胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相對表達量的比較（±s）

注：a與空白組細胞比較，P＜0.05；b與轉染組細胞比較，P＜0.05；c與順鉑組細胞比較，P＜0.05

組別空白組轉染組順鉑組轉染+順鉑組F值P值P I 3 K 0.8 9±0.1 2 0.5 3±0.0 8 a 0.5 9±0.0 7 a 0.2 7±0.0 4 a b c 4 7.4 7 3 0.0 0 0 p A K T/A K T 1.0 4±0.1 2 0.7 9±0.0 8 a 0.8 2±0.0 9 a 0.2 8±0.0 4 a b c 6 7.8 2 0 0.0 0 0 M T O R 0.8 5±0.0 9 0.4 8±0.0 7 a 0.5 1±0.0 8 a 0.2 4±0.0 4 a b c 6 0.0 0 0 0.0 0 0 p 7 0 S 6 0.8 2±0.1 0 0.4 9±0.0 9 a 0.5 5±0.0 8 a 0.2 5±0.0 5 a b c 4 0.6 1 1 0.0 0 0

3 討論

胃癌是多基因、多因素綜合作用導致的惡性腫瘤，環境、遺傳、生活習慣及幽門螺桿菌感染等均是其危險因素[8]。由于該病早期癥狀隱匿且缺乏特異性，多數患者在確診時已處于中晚期，僅能采用以化療為主的保守治療手段。順鉑是直接作用于DNA的鉑類化療藥，已被廣泛應用在胃癌的治療中，可延長患者生存期，但由于易發生耐藥，整體療效不佳。目前，細胞耐藥的相關機制并未明確，有學者認為，可能與細胞增殖及凋亡失衡相關[9]，且是多基因、多種調控機制聯合作用的結果。劉蒙等[10]研究顯示，下調CDH10的表達可抑制順鉑耐藥細胞的增殖能力，增強胃癌細胞對順鉑的敏感性。PCDH10與肝腸鈣黏蛋白17（liver-intestinecadherin，LI-cadherin，又稱 CDH17）同屬鈣黏蛋白超家族成員，二者生理功能相似，因此，可推測PCDH10與胃癌患者順鉑耐藥相關，探討其對順鉑的敏感性及相關機制對逆轉胃癌細胞耐藥、改善預后至關重要。

PCDH10主要表達于中樞神經系統，在細胞內信號傳導、細胞間黏附中發揮重要作用。有報道證實[11-12]，PCDH10基因啟動子區的CpG島異常甲基化，可破壞細胞信號轉導通路，促使細胞向惡性轉化發生癌變，且該機制在多種惡性腫瘤中均存在。田浩等[13]研究顯示，胃癌組織中PCDH10蛋白相對表達量明顯低于癌旁組織，且其表達水平與胃癌TNM分期、淋巴結轉移及遠期預后關系密切。本研究通過建立過表達PCDH10的人胃癌BGC823細胞，結果發現，穩定轉染各組細胞重新接種，轉染組培養24、48、72 h時的OD值、培養24 h時的遷移率和穿膜細胞數均降低，表明過表達PCDH10可降低胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力，與Ye等[14]關于PCDH10在肝癌細胞中作用機制的研究結果相似。近年來，臨床對腫瘤遷移侵襲與化療多藥耐藥間的研究逐漸深入，有學者認為，腫瘤細胞在產生耐藥性的同時，遷移侵襲相關信號通路被激活，導致細胞遷移侵襲能力增強[15]。由此可見，腫瘤轉移與耐藥性的產生可能并非孤立事件，二者在功能上存在某種聯系。本研究結果顯示，不同順鉑濃度下，轉染組細胞存活率、順鉑對細胞的IC50值均低于空白組和空載組細胞，表明過表達PCDH10可增強細胞對順鉑的敏感性。

PI3K為蛋白激酶家族成員，AKT為其下游直接效應蛋白。細胞表面的PI3K被胞外刺激信號激活后，AKT位點被磷酸化，磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）進入細胞中，開啟轉導PI3K始動生物信息功能，激活下游效應基因，啟動炎性反應。研究顯示，多種惡性腫瘤中普遍存在PI3K/AKT信號通路的活化[16-17]，廣泛參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等過程。李沐涵等[18]使用PI3K/AKT通路抑制劑阻斷該通路后，胃癌MGC-803細胞的侵襲能力明顯受抑制。MTOR為高度保守進化的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可調控細胞分裂與合成代謝，與PI3K/AKT通路密切相關[19]，可直接被AKT激活或接收生長因子信號而活化，進一步激活下游蛋白p70S6，進而加快肌動蛋白細絲重構與mRNA的翻譯過程，調控蛋白生成，促進細胞增殖。付漢東等[20]研究顯示，MTOR、p70S6在胃癌組織中呈異常高表達狀態，且與疾病臨床與病理特征相關。本研究中，人胃癌BGC823細胞經PCDH10轉染及順鉑干預后，PI3K、MTOR、p70S6mRNA的相對表達量均下調，且PI3K、MTOR、p70S6蛋白的相對表達量及pAKT/AKT均降低，且轉染+順鉑對其表達調控作用更加顯著，表明過表達PCDH10增強細胞順鉑敏感性的機制可能與下調PI3K、MTOR、p70S6mRNA及PI3K、MTOR、p70S6蛋白表達、抑制AKT磷酸化相關，推測PCDH10可作為臨床增強胃癌細胞順鉑敏感性的靶向基因。

綜上所述，PCDH10過表達可抑制人胃癌BGC823細胞的增殖、遷移、侵襲能力，并可增強細胞順鉑化療敏感性，其作用機制可能與下調PI3K、MTOR、p70S6mRNA 及 PI3K、MTOR、p70S6蛋白表達、抑制AKT磷酸化相關。本研究為臨床進一步明確PCDH10信號通路在胃癌多藥耐藥中的作用機制、逆轉胃癌耐藥提供了理論依據。