滋陰補腎丸質量標準研究

汪愛霞，孫 蕓，郭文賓

（1. 甘肅河西制藥有限責任公司，甘肅 張掖 734000； 2. 甘肅省張掖市食品藥品檢驗檢測中心，甘肅 張掖 734000）

滋陰補腎丸為包衣水丸，由生曬參、五味子（制）、山藥、鎖陽、黃芪、巴戟天、山茱萸等中藥組方，具有滋陰壯陽、益精填髓功效，主要用于腰膝酸痛、夢遺滑精、陽痿早泄等癥。該制劑收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第七冊）》，有顯微鑒別項，無其他定性或定量指標。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對人參、山藥、五味子、山茱萸對照藥材進行定性鑒別，采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法測定黃芪中黃芪甲苷的含量［1-10］，為該制劑的質量控制提供檢驗依據?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030 型高效液相色譜儀，包括SIL-20AC 自動進樣器、LC-20AD 四元泵、CTO-20AC 柱溫箱（日本島津公司）；Alltech 6000 型蒸發光散射檢測器（美國奧泰公司）；AG-135 型電子天平（精度為十萬分之一），ME204E 型電子天平（精度為萬分之一），均由梅特勒-托利多儀器有限公司提供；ZFC-2 型三用紫外分析儀（上?？岛坦怆妰x器有限公司）；KQ5200DE 型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司，功率為240 W，頻率為45 kHz）。

1.2 試藥

人參皂苷Rb1對照品（批號為110704-201827），人參皂苷Rg1對照品（批號為110703-201731），人參皂苷Re 對照品（批號為110754-201827），黃芪甲苷對照品（批號為110781-200613，含量以100%計），五味子醇甲對照品（批號為110857-201714），熊果酸對照品（批號為110742-200517），人參對照藥材（批號為120917-201110），五味子對照藥材（批號為120922-201610），山藥對照藥材（批號為121137-201606），山茱萸對照藥材（批號為121495-201303），均購自中國食品藥品檢定研究院；滋陰補腎丸（甘肅河西制藥有限責任公司，批號分別為170501，170502，171201，規格為每袋5 g）；陰性樣品（甘肅河西制藥有限責任公司自制）；硅膠GF254薄層板（批號為20180803），硅膠G 薄層板（批號為20190506），均購自青島海洋化工廠；甲醇（批號為63Y1811CR，純度為99.9%），乙腈（批號為32Y1906HB，純度為99.9%），均為色譜純，均購自美國ACS 恩科化學有限公司，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

人參和黃芪：取樣品適量，研細，取約6 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取7 h，提取液回收甲醇至干，殘渣加水25 mL，微熱使溶解，用乙醚輕搖洗滌2 次，每次20 mL；水溶液再用水飽和的正丁醇振搖提取6 次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3 次，每次40 mL，正丁醇液回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液作為供試品溶液。同法制備人參對照藥材溶液。再取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re 對照品及黃芪甲苷對照品，分別加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。取不含人參和黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液與對照藥材溶液各10 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15 ∶40 ∶22 ∶10，V/ V/ V/ V）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，展距18 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 人參和黃芪薄層色譜圖

五味子：取樣品6 g，研細，加70%甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣用0.1 mol / L 的氫氧化鈉溶液20 mL 溶解，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取五味子對照藥材1 g，同法制備對照藥材溶液。再取五味子醇甲對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。取不含五味子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（30 ～60 ℃）-甲酸乙酯-甲醇（15 ∶5 ∶0.3，V/ V/ V）為展開劑，展開，展距15 cm，取出，晾干，在紫外光（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖2 A。

山藥：取樣品5g，研細，加甲醇30mL，超聲處理30min，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加水20 mL 使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流1 h，冷卻，用三氯甲烷振搖提取2 次，每次25 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取山藥對照藥材2 g，同法制備對照藥材溶液。取不含山藥的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-丙酮（9 ∶1.5，V/ V）為展開劑，展開，展距17 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖2 B。

圖2 五味子、山藥和山茱萸薄層色譜圖

圖3 高效液相色譜-蒸發光散射檢測器色譜圖

山茱萸：取樣品5 g，研細，加水30 mL，放置使溶散，用濾紙濾過，藥渣再用水30 mL 洗滌，在室溫干燥至呈松軟的粉末狀，于100 ℃烘干，連同濾紙一并置索氏提取器內，加乙醚適量，加熱回流提取4 h，提取液回收乙醚至干，殘渣用石油醚（30 ～60 ℃）浸泡2 次，每次15 mL（浸泡約2 min），傾去石油醚，殘渣加無水乙醇-三氯甲烷（3 ∶2，V/ V）混合液3 mL，微熱使溶解，作為供試品溶液。取山茱萸對照藥材1 g，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇2 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。另取熊果酸對照品，加無水乙醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。取不含山茱萸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（20 ∶5 ∶8，V/ V/ V）為展開劑，展開，展距8 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖2 C。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：HypersilODS2C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（35 ∶65，V/ V）；檢測器：蒸發光散射檢測器；流速：1 mL / min；N2流速：2.7 L / min；柱溫：30 ℃；進樣量：5，20 μL；霧化器溫度：99.3 ℃。

2.2.2 溶液制備

取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對照品貯備溶液。精密量取對照品貯備液5 mL，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，即得對照品溶液。按2.1 項下方法制備供試品溶液。取不含黃芪藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2 項下3 種溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果陰性對照無干擾，專屬性強。色譜圖見圖3。

線性關系考察：取黃芪甲苷對照品11.31 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，得對照品母液（質量濃度為0.226 2 mg/mL），再分別精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，稀釋成不同質量濃度的對照品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣10 μL，測定色譜峰，計錄色譜峰面積，以黃芪甲苷進樣量的對數（X）為橫坐標、峰面積積分值的常用對數（Y）為縱坐標作標準曲線，得黃芪甲苷回歸方程Y=1.570 3X+5.529 5，r=0.999 0 （n=6）。結果表明，黃芪甲苷進樣量在11.31 ～67.86 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，6，12，24 h 時進樣20 μL 測定，記錄黃芪甲苷色譜峰的峰面積。結果的RSD為0.66%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定。

精密度試驗：精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續進樣6 次，按擬訂色譜條件測定峰面積。結果的RSD為0.14%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為171201）樣品共6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，并測定含量。結果黃芪甲苷平均含量為0.070 mg/g，RSD為2.16%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為171201）3.0 g，精密稱定，共9 份，分別精密加入2.2.2項下高、中、低劑量的黃芪甲苷對照品貯備液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗結果（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取滋陰補腎丸3 批，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，以外標兩點法對數方程計算含量。結果批號分別為170501，170502，171201 的3 批樣品中黃芪甲苷含量分別為0.066 9，0.067 4，0.070 0 mg/g，平均0.068 1 mg/g。

3 討論

3.1 提取條件優化

通過試驗，對提取溶劑（甲醇、70% 甲醇溶液和50%甲醇溶液）、提取方法（超聲、索氏提?。┖吞崛r間（4 h 和7 h）進行比較。結果表明，用甲醇索氏提取7 h為最優提取條件。

3.2 測定方法選擇

黃芪甲苷含量測定方法有HPLC 法（紫外檢測器與蒸發光散射檢測器）、薄層掃描法、熒光法等［11-13］。該制劑藥味較多，成分復雜，薄層色譜定量測定方法重復性及穩定性較差，選用薄層色譜法進行黃芪甲苷定性鑒別。黃芪甲苷屬四環三萜類皂苷，λmax為200.08 nm，為紫外末端吸收，紫外檢測靈敏度低，干擾因素多［14］，不適用于紫外檢測器。HPLC 法（蒸發光散射檢測器）為質量型通用檢測器，其響應大小決定于被分析物質顆粒的數量和大小，而不受流動相溶劑的干擾，不要求被檢測組分有特定的化學結構［15］，適用于結構中無共軛體系、紫外吸收較弱的化合物，選用該方法靈敏度高，重復性好，結果無干擾。