高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定接骨七厘片中總砷含量及砷形態(tài)分析

朱 瓊，方 靜，蔡 鵬，錢(qián)保勇

（江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 泰州 225300）

接骨七厘片是由醋乳香、醋沒(méi)藥、當(dāng)歸、土鱉蟲(chóng)、龍血竭、酒大黃等藥材加工制成的中成藥，具有活血化瘀、接骨止痛的功效［1］，能促進(jìn)骨折愈合，增強(qiáng)抗折作用，對(duì)小鼠醋酸致痛有鎮(zhèn)痛作用，臨床應(yīng)用廣泛。但接骨七厘片中的有害元素時(shí)有超標(biāo)［1］，特別是砷超標(biāo)需引起重視。為控制接骨七厘片的質(zhì)量，評(píng)價(jià)其安全性，砷的測(cè)定十分有必要。砷的毒性根據(jù)其不同形態(tài)有著顯著差異，亞砷酸鹽As（Ⅲ）和砷酸鹽As（Ⅴ）是毒性最大的無(wú)機(jī)砷，一甲基砷（MMA）和二甲基砷（DMA）的毒性較弱，而砷甜菜堿（AsB）和砷膽堿（AsC）無(wú)毒。為了科學(xué)地評(píng)估接骨七厘片中的砷毒性，確定其安全使用的含量范圍，有必要對(duì)砷形態(tài)進(jìn)行分析。目前，中藥中總砷的測(cè)定方法主要有氫化物原子熒光法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法，對(duì)砷形態(tài)的分析方法主要有高效液相色譜-氫化物原子熒光法、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（HPLC-ICP-MS）［2-3］。本研究中采用HPLC-ICPMS 法對(duì)中成藥中砷形態(tài)進(jìn)行了含量測(cè)定，并制訂了相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可為研究其他中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex 公司）；ICP -Q 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛公司）；梅特勒電子天平（美國(guó)梅特勒公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)為175385-28，1000μg/mL），亞砷酸鹽As（Ⅲ）（批號(hào)為144014-7，1 000 μg/mL），砷酸鹽As（Ⅴ）（批號(hào)為976236-2，1 000 μg/mL），均購(gòu)自美國(guó)O2Si Smart Solutions 公司；砷甜菜堿［批號(hào)為1509，以砷計(jì)（38.8±1.1）μg/g］，砷膽堿［批號(hào)為1512，以砷計(jì)（28.1±1.1）μg/g］，一甲基砷［批號(hào)為16072，以砷計(jì)（25.1±0.8）μg/g］，二甲基砷［批號(hào)為1607，以砷計(jì)（52.9±1.8）μg/g］，均購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；接骨七厘片（湖南金沙藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為161235，161237，170120）；硝酸為色譜純，水由Milli-Q系統(tǒng)制得；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 砷形態(tài)分析

2.1.1 HPLC-ICP 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：等離子體功率為1 550 W，載氣為高純氬氣；載氣流速為1.0 L/min；采樣深度為5 mm；冷卻氣流量為14 L/min；輔助氣流量為0.8 L/min；載氣流量為0.9 L/min；數(shù)據(jù)重復(fù)采集次數(shù)為3 次。

色譜條件：賽默飛AS7 陰離子交換柱（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相為10 mmol/L 碳酸銨（A），100 mmol/L碳酸銨（B），梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。記錄離子流圖（見(jiàn)圖1）。

時(shí)間（min）流動(dòng)相B（%）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）0 3 5 100 50 50 0 50 50 8 10 100 100 0 0

圖1 離子流圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及線性關(guān)系考察

精密量取砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，逐級(jí)稀釋配制成含砷為0，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 ng/mL 的系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，照2.1.1 項(xiàng)下條件測(cè)定。取10個(gè)空白溶液測(cè)定空白強(qiáng)度值，按空白值的3 倍標(biāo)準(zhǔn)差和10 倍標(biāo)準(zhǔn)差分別計(jì)算檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）。

取6 種形態(tài)砷，精密稱定，分別用去離子水配制成As（Ⅲ）的質(zhì)量濃度分別為0，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 μg/L；As（V）的質(zhì)量濃度分別為0，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 μg/L；MMA 的 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為0，1.00，2.00，4.00，8.01，16.02，20.02 μg/L；DMA 的質(zhì)量濃度分別為0，1.00，2.01，4.02，8.03，16.06，20.08 μg/L；AsB 的質(zhì)量濃度分別為0，1.02，2.04，4.08，8.15，16.30，20.38 μg/L；AsC 的質(zhì)量濃度分別為0，1.00，2.01，4.02，8.04，16.08，20.10 μg/L。按2.1.1 項(xiàng)下條件測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。取10 個(gè)空白溶液測(cè)定空白強(qiáng)度值，并計(jì)算LOD 和LOQ，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與靈敏度考察結(jié)果

2.2 總砷含量測(cè)定

2.2.1 質(zhì)譜條件

同2.1.1 項(xiàng)下質(zhì)譜條件。

2.2.2 溶液制備

取樣品（去包衣），粉碎，混勻，取粉末0.50 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入人工腸液20 mL，超聲15 min，放置過(guò)夜。次日放入37.5 ℃烘箱中提取3 h，每隔0.5 h 振搖錐形瓶1 min。提取完畢，吸取中層濾液10 mL，用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液5 mL，再用0.02 mol/L乙二胺四醋酸二鈉（EDTA）溶液稀釋至50 mL 容量瓶中即得砷形態(tài)溶液。

取樣品（去包衣）0.25 g，精密稱定，置微波消解罐中，加入硝酸7 mL，加蓋密閉，在100 ℃下預(yù)消解15 min，冷卻，然后放入微波消解儀中消解。消解采用程序升溫，20 ℃升至110 ℃，保持8 min；110℃升至160 ℃，保持6 min；160 ℃升至180 ℃，保持25 min。待消解完全后，當(dāng)冷卻溫度至低于45 ℃時(shí)，取出消解罐，繼續(xù)放冷至室溫，將消解后的溶液定量至50 mL 容量瓶中，用少量超純水潤(rùn)洗消解罐4 次，合并至容量瓶中，用超純水定容，搖勻，放置，取上清液作為總砷測(cè)定的供試品溶液。依法制備空白溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為161235）粉末，分別加入高、中、低質(zhì)量濃度（16，8，2 ng/mL）的AsB、AsC、MMA、DMA、As（Ⅲ）、As（V）、總砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3 個(gè)平行樣，按擬訂方法測(cè)定，計(jì)算RSD。結(jié)果見(jiàn)表3，RSD在1.78% ～7.20%之間，精密度符合微量元素分析的要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8 h 時(shí)按擬訂條件測(cè)定。結(jié)果AsB，AsC，MMA，DMA，As（Ⅲ），As（V）和總砷離子強(qiáng)度的RSD均小于5.00% （n= 5），表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品粉末（批號(hào)為161235），平行配制6 份砷形態(tài)樣品和6 份總砷樣品，按擬訂條件測(cè)定，根據(jù)砷形態(tài)測(cè)定結(jié)果計(jì)算的RSD為3.12% ～6.64%（n=6），根據(jù)總砷的測(cè)定結(jié)果計(jì)算的RSD為2.32%（n=6），符合微量元素分析要求。

加樣回收試驗(yàn)：在已知含量的樣品（批號(hào)為161235）粉末中分別加入高、中、低質(zhì)量濃度（16，8，2 ng/mL）的AsB，AsC，MMA，DMA，As（Ⅲ），As（V）和總砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3 個(gè)平行樣，按擬訂條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表4，其范圍在89.15% ～99.95%之間，RSD符合微量元素分析要求。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

按擬訂條件測(cè)定3 批樣品中總砷和砷形態(tài)的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 AsB、AsC、MMA、DMA、As（Ⅲ）、As（V）、總砷精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 提取溫度選擇

比較人工胃液、人工腸液、水提液3 種提取方式在37.5 ℃的提取率，結(jié)果水提取和人工胃液提取的含量都很低，但人工腸液提取率略好。設(shè)置人工腸液提取的溫度分別為37.5，60，90，120℃，結(jié)果90℃提取效率最高，當(dāng)提取溫度繼續(xù)增加至120 ℃時(shí)，As（Ⅲ）含量變低，As（Ⅴ）含量變高，提示砷形態(tài)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變。為了保證提取效率和砷形態(tài)不發(fā)生變化，故選擇人工腸液在90 ℃提取［4-6］。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（±s，%，n=3）

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（±s，%，n=3）

加樣質(zhì)量濃度（ng/mL）AsB AsC MMA DMA As（Ⅲ）As（V）總砷16 8 2 91.22±6.51 93.46±5.44 92.57±5.91 90.91±3.23 94.02±4.62 92.20±6.24 92.95±6.10 94.27±5.63 94.52±7.10 95.89±5.52 96.26±7.14 95.23±6.29 92.92±7.00 89.15±6.57 93.73±5.17 94.63±5.93 92.58±5.25 94.89±5.71 98.23±3.25 99.95±2.56 98.37±3.02

表5 3 批樣品中砷形態(tài)測(cè)定結(jié)果（mg/kg，n=3）

3.2 流動(dòng)相選擇

2015年版《中國(guó)藥典（四部）》中砷形態(tài)測(cè)定采用的是0.025 mol/L 磷酸二氫銨（氨水調(diào)節(jié)pH 至8.0）為流動(dòng)相，本研究中采用的是碳酸銨為流動(dòng)相，是因?yàn)榱姿岫滗@更易污染質(zhì)譜的采樣錐，易導(dǎo)致質(zhì)譜熄火，而碳酸銨系統(tǒng)進(jìn)入ICP-MS 后，被分解成易揮發(fā)的氣體，不會(huì)產(chǎn)生殘留，可減少質(zhì)譜熄火等情況的發(fā)生。同時(shí)，高鹽樣品經(jīng)過(guò)電感耦合等離子體時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生信號(hào)漂移，應(yīng)以質(zhì)控樣品或?qū)φ杖芤哼M(jìn)行回測(cè)，或采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。

3.3 溶劑選擇

對(duì)供試品進(jìn)行前處理時(shí)，最后需將樣品用EDTA 溶液進(jìn)行稀釋定容，可有效降低溶劑效應(yīng)，分離效果更好，其質(zhì)譜離子流圖也更滿意，特別是AsB 和MMA 的峰形會(huì)更尖銳，否則會(huì)出現(xiàn)雙峰及拖尾［7-12］。

3.4 分離方法選擇

目前，分離形態(tài)砷的方法主要有高效液相色譜-氫化物原子熒光法和HPLC-ICP-MS 法。前者分離時(shí)間較長(zhǎng)，出峰時(shí)間短，峰形較差。HPLC-ICP-MS 法分離時(shí)間較短，且配制試劑較少，測(cè)定結(jié)果更穩(wěn)定，該方法可用于藥物體內(nèi)代謝途徑及部位的研究［13-14］。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了測(cè)定接骨七厘片中砷形態(tài)的HPLC-ICP-MS 法，同時(shí)采用ICP-MS 法對(duì)接骨七厘片中的總砷進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。不同批次接骨七厘片中砷形態(tài)含量存在差異，其中As（V）含量最高，其次是As（Ⅲ），還含有少量的MMA，DMA，AsB 和AsC均未檢測(cè)到。由可溶性砷含量的測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，接骨七厘片中的砷主要是可溶性砷，以可溶性砷中的As（V）含量最高。