富血小板血漿聯合強骨膠囊對大鼠骨質疏松性骨折骨愈合的影響

黃 星 歐銳金 李國興

廣東省羅定市人民醫院骨科(羅定 527200)

骨質疏松是臨床常見的骨科疾病，在臨床主要表現為骨量以及骨密度的顯著性下降，在骨質疏松患者的疾病進展過程中，骨折是較為常見的并發癥之一[1]，嚴重威脅患者的生命質量。生理學研究發現[2]，在對骨質疏松患者的疾病進展中，破骨細胞發揮主導作用。而在骨折患者的重建過程中，由于病灶部位的骨折的重建速度過快，造成患者骨痂力度形成的強度不足[3]。在臨床對患者的治療過程中，富血小板血漿通過對多種炎性因子的釋放作用，促進患者的細胞增殖、分化以及血管的形成，對于患者的預后具有積極的意義[4]。強骨膠囊的主要成分為骨碎補，通過對患者的骨量的增加，對于患者骨痂的愈合具有積極的意義[5]。本研究通過對富血小板血漿聯合強骨膠囊對大鼠骨質疏松性骨折骨愈合的影響分析，為臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和材料

80只未交配、3月齡雌性健康SD大鼠，所有大鼠平均體質量為(202.45±2.12)g，室溫控制在(21±2)℃，濕度30%～70%，光照每晝夜12 h。將以上大鼠分為空白組(K組)、 PRP組(P組)、強骨膠囊組(Q組)，聯合組(L組)，每組大鼠20例，實驗全程嚴格按照國家有關實驗動物的規定執行，經醫院生物醫學研究倫理委員中心批準。

1.2 研究方法

對所有的實驗大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，皮膚消毒，暴露兩側卵巢及輸卵管，結扎輸卵管后切除雙側輸卵管，縫合傷口，連續3日每日肌注青霉素。3月后骨質疏松模型建立。

大鼠自體富血小板血漿制備，與骨質疏松性骨折模型前一天，眼眶采血采集P組及L組靜脈血2 mL，將血液介入含有枸櫞酸鈉溶液的離心管中，顛倒使其充分混勻，將大鼠做好標記。采用二次離心法中的landsbergs法，制備PRP；①先予3 659轉/min的速率離心10 min，取血漿層及兩層交界面下2 mm的液體放置于另外一新的離心管中，②以3000轉/min的速率離心10 min，液體分為兩側，取剩下的1/4層即為PRP，將制備好PRP加入凝血酶激活劑，搖勻，PRP凝膠狀后置入- 20 ℃冰箱備用。

建立骨質疏松性骨折內固定大鼠模型。腹腔注射戊巴比妥麻醉后，取左后肢剃毛皮膚消毒，無菌條件下于脛骨前面上1/3中心作長約1.5 cm縱行切口，鈍性分離組織，鋸斷脛骨，骨折端復位后予醫用無菌1.0克氏針穿髓腔固定骨折端，并將克氏針尾端作折彎處理；同時P組及L組大鼠骨折端保持無菌環境注入制備好的PRP；縫合皮下組織及皮膚，術后每次大鼠每日肌注青霉素10萬U兩側，連續3天。

聯合用藥組大鼠：強骨膠囊(骨碎補總黃酮)為北京岐黃藥業提供，每克藥中含骨碎補總黃酮含量為0.66 g，每粒藥重2.5 g，使用時加蒸餾水配制成固定的濃度(劑量0.108·kg-1·d-1)，用大鼠灌胃針灌胃。

1.3 觀察指標

1.3.1 四組大鼠骨痂顯微形態比較。分別對四組大鼠的脛骨進行采集標本，使用顯微CT對實驗大鼠標本的進行斷層掃描以及三維重建，對實驗大鼠的骨痂形態進行分析。骨痂的形態主要包括骨小梁體積、數量、厚度、分離度、連接密度以及表面積體積比之間的差異。

1.3.2 四組患者的生物力學指標比較。于骨質疏松性骨折造模術后6周，每組各取5只大鼠，麻醉后行X線檢查，檢查后脫頸處死，剃毛，消毒，于原切口瘢痕出取出脛骨，剝離組織，隨機將其浸泡于10%福爾馬林溶液(pH=7.4)中固定72 h，72 h后將標本予磷酸緩沖鹽溶液浸泡沖洗15 min，重復3次；之后放入裝有75%酒精的標本被中，并置于4 ℃冰箱中保持備用，予同樣方法取對側整根脛骨，由生理鹽水浸濕后的濕紗布包裹放入- 20 ℃冰箱中備用，復溫后進行生物力學測試。對大鼠脛骨進行壓縮試驗，將標本從- 20 ℃取出，復溫，放置于生物力學試驗機上進行壓縮試驗，加載速度設定為2 mm/min，先予加載10N三次，3次完全卸載后再觀察是否歸零。每個標本進行3次。最后給予加載100N一次，觀察最大載荷，記錄結構最大載荷、結構能量吸收、材料最大應力、材料能量吸收。

1.3.3 四組大鼠的組織形態學比較。用于病理組織學檢查的手術側脛骨標本，經脫鈣6周后，將標本脫水處理，脫水后予石蠟包埋制成蠟塊標本，轉輪式切片以厚度為4 μm為準，連續切片，30 ℃烤片過夜，備用。取切片后的骨組織，行HE染色，于顯微鏡下比較切片內骨架面積(mm2)及軟骨或骨性骨痂面積比。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，所有計量資料采用獨立樣本t檢驗進行對比。兩兩比較，采用LSD-t檢驗，計量資料以[n(%)]，P<0.05說明差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 四組大鼠骨痂顯微形態比較

四組大鼠的骨小梁體積、數量、厚度、分離度、連接密度以及表面積體積比之間的差異存在統計學意義(P<0.05)，經過兩兩比較，聯合用藥組患者的骨小梁體積、數量、厚度、連接密度高于單獨用藥組，分離度、表面積體積比低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 四組大鼠骨痂顯微形態比較 n=20

2.2 四組患者的生物力學指標比較

四組大鼠的結構最大載荷、結構能量吸收、材料最大應力、材料能量吸收之間的差異存在統計學意義，聯合用藥組患者的最大載荷、結構能量吸收、材料最大應力、材料能量吸收高于單獨用藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 四組患者的生物力學指標比較 n=20

2.3 四組大鼠的組織形態學比較

四組患者的骨架面積及軟骨或骨性骨痂面積比之間的差異存在統計學意義(P<0.05)，經過兩兩比較，聯合用藥組患者的骨架面積及軟骨或骨性骨痂面積比高于單獨用藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 四組大鼠的組織形態學比較 n=20

圖1 A為對照組，B為聯合治療組

3 討 論

隨著年齡的增長，患者的骨質疏松發病率顯著升高，有研究認為[6]，隨著患者骨組織的不斷衰老，其鈣鹽以及基質的比例顯著發生變化，骨質疏松患者多見于絕經后的女性以及老年男性。在骨質疏松骨折患者中，多見于退行性骨質疏松，患者表現為顯著的身長縮短以及駝背[7]。在對骨質疏松患者的血清學指標的分析中，其血清鈣、磷含量通常處于正常水平，骨折患者在痊愈后可表現為堿性磷酸酶水平的異常增高[8]。富含血小板的血漿可通過對患者的多種細胞因子的釋放，改善患者的細胞愈合、增殖，對于患者的骨折部位的愈合具有積極的意義。強骨膠囊的主要成分為骨碎補總黃酮，該種成分對于患者的骨骼新陳代謝水平具有重要意義[9]。

本研究中采用的動物模型為女性絕經后的骨質疏松，在對實驗大鼠直視的情況下，對實驗大鼠進行骨折模型的制備。研究認為[10]，在實驗大鼠的骨折后，骨折病灶部位的修復過程中，在軟骨細胞的形成以及成熟過程中，通過軟骨細胞的肥大作用，其基質發生溶解鈣化，同時，新生的血管通過對軟骨內組織的浸潤，進一步促進成骨細胞的形成，最終促進患者的骨痂愈合[11]。在此過程中，隨著對實驗大鼠的富含血小板的血漿使用，通過對實驗大鼠多種細胞因子的分泌，促進成骨細胞以及軟骨細胞的增殖，對于患者的骨痂愈合具有重要的意義[12]。而在對實驗大鼠采用強骨膠囊治療，通過對實驗大鼠的骨質新陳代謝水平的升高，對于骨折的預后具有積極的作用[13]。在本研究中，聯合用藥組患者的骨小梁體積、數量、厚度、連接密度顯著高于單獨用藥組，分離度、表面積體積比顯著低于對照組；聯合用藥組患者的最大載荷、結構能量吸收、材料最大應力、材料能量吸收顯著高于單獨用藥組；聯合用藥組患者的骨架面積及軟骨或骨性骨痂面積比顯著高于單獨用藥組，提示，通過聯合用藥，實驗大鼠的骨質密度以及抗壓性顯著提升，同時通過對骨痂面積比例的分析，實驗大鼠的骨痂面積顯著降低，由此造成的局部炎性反應水平相對降低[14]。研究認為，在實驗大鼠的病變過程中，由于實驗大鼠處于高度應激反應過程中，由此造成的實驗大鼠血管內皮細胞的損傷，局部炎性因子大量分泌，在一定程度上抑制了骨質的愈合[15]。而在實驗大鼠的治療中， 通過采取強骨膠囊以及富含血小板的血漿治療中，通過聯合治療，共同發揮協同作用，治療效果顯著。

綜上所述，富血小板血漿聯合強骨膠囊通過對骨折部位骨質密度以及骨質強度的顯著增強，大鼠骨質疏松性骨折骨愈合情況良好。