河源地區機采血小板固定獻血者血小板抗原系統基因多態性分析

歐小懂 葉登凰 黃 璐 黃仕云 陳勇芳 邱美麗

河源市中心血站(河源 517003)

人類血小板同種抗原(human platelet alloantigen，HPA)是分布在血小板糖蛋白上一類特異性抗原，又稱血小板特異性抗原。HPA 屬于雙等位共顯性遺傳系統，分別位于第 5、6、17、22 號染色體上的 6 個遺傳位點。因其核苷酸堿基缺失或單核苷酸多態性替換導致相應位置單個氨基酸的變異[1]，表現血小板獨特的遺傳多態性[2]。研究已證實 HPA 多態性分布存在種族差異[3]和地域差異[4]，同時與血小板輸注無效(PTR)、輸血后血小板減少性紫癜(PTP)等疾病相關。從2009年起我國開始推進機采血小板獻血者HPA 基因庫的建立，主要集中在各省血液中心，建設規模普遍不大，覆蓋面有限。建立地方血站HPA 基因庫，對解決本地區長期需要機采血小板治療的患者的輸注無效問題具有重要意義。HPA基因分型方法、檢測指標及血小板基因庫規模缺乏統一標準，各血站采用的試劑盒、引物未經過權威部門室間質評驗證，難以保證結果的一致性。目前HPA基因分型方法主要采用聚合酶鏈反應核苷酸特異性引物技術、聚合酶鏈反應序列特異性寡核苷酸探針技術、核苷酸序列測定法等。HPA檢測指標在各個血站存在差異，如檢測 HPA 1- 6，15、HPA 1-17w、HPA 1- 21w。本研究主要采用聚合酶鏈反應核苷酸特異性引物技術(PCR-SSP)方法分析河源地區機采血小板固定獻血人群HPA1～17系統的基因多態性，為建立本地區HPA分型機采血小板供血者庫奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象

隨機選擇河源市中心血站機采血小板固定獻血者100例為研究對象，年齡為18～50周歲(中位年齡為29周歲)。所有研究對象在本血站近兩年內捐獻機采血小板至少3次，并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

人類基因組DNA提取試劑由北京天根生化科技有限公司提供；HPA基因分型試劑由天津市秀鵬生物技術開發有限公司提供；擴增儀由美國ABI7500提供；電泳儀北京君意東方電泳設備有限公司提供。

1.3 人類血小板同種抗原 HPA1～17基因分型

1.3.1 人類全血基因組DNA提取 取400 μL抗凝血，嚴格按照說明書操作要求，收集DNA溶液至離心管中，保存- 80 ℃冰箱備用。要求：DNA使用最佳濃度為30～50 ng/μL，A260/A280值為1.6～2.0。

1.3.2 PCR擴增 采用PCR-SSP方法，每人份34個孔位，每個孔位反應體系： BUFFER(含引物) 320 μL +Taq酶3.3 μL+DNA50 μL 。再加入 15～20 μL石蠟油。將封板膜重新覆上反應板置于PCR 儀樣本槽相應位置，并記錄放置順序。 按表1參數設置，進行PCR擴增。

表1 PCR擴增運行參數

1.3.3 凝膠電泳成像 將每個PCR反應產物(10 μL)轉移到 2.5%瓊脂糖凝膠孔中。電泳參數：電壓：140～150V；時間：15～20 min(內參帶與陽性帶清晰分開時即可停止電泳)。紫外凝膠成像系統下觀察結果并拍攝成像，保存試驗結果。

1.4 統計學方法

采用基因計數法計算基因頻率?；蝾l率f(a)或f(b)=基因數f(a)或 f(b)/該基因的等位基因總數。雜合度頻率f(ab)=雜合子f(ab)/該基因的等位基因總數。不配合率= f(ab)×[1- f(a)×f(b)]。采用χ2檢驗分析基因型觀察值與期望值是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡。

2 結 果

2.1 等位基因電泳結果

100例機采血小板固定獻血者獲得 HPA 1～17基因擴增產物凝膠成像圖，主要為aa表型。HPA- 2、HPA- 3、HPA- 5、HPA-15系統具有多態性并存在aa、ab、bb3種表型。其中2個樣本 HPA 基因檢測結果為：1aa2aa3ab4aa5aa6aa15bb7aa8aa9aa10aa11aa 12aa13aa14aa16aa17aa，見圖1(含3ab、15bb)；基因分型結果為：1aa2aa3aa4aa5aa6aa15ab7aa8aa9aa 10aa11aa12aa13aa14aa16aa17aa，見圖2(含15ab)。

圖1 HPA1～17等位基因電泳圖

圖2 HPA1～17等位基因電泳圖

2.2 HPA1～17等位基因頻率

100例機采血小板固定獻血者HPA1～17基因中成多態性分布的等位基因是HPA2a、HPA3a、HPA5a、HPA15a，其頻率分別為0.96、0.49、0.99、0.515。HPA1a、HPA4a、HPA6a-14a、HPA16a、HPA17a基因頻率為1，呈單線性分布，未發現b基因。見表2。

表2 無償獻血者HPA1-17等位基因分布結果

3 討 論

血小板輸注是預防和改善因血小板減少或血小板功能障礙引起出血的重要治療手段[5]。隨著臨床輸血技術的快速發展，血小板的臨床應用日益增多，血小板輸注過程中所產生的問題特別是血小板輸注無效[6]的問題亦日益突出。 目前國際上用于 PTR 患者血小板供者篩選的方法主要有兩種：基于 HLA/HPA 特異性配型原則的篩選和基于交叉配合試驗的篩選[7]。 對于血小板抗體篩選陽性的PTR 患者，HLA/HPA 配型可顯著提高血小板交叉試驗陰性率，提高血小板輸注治療效果。2003年，血小板命名委員會對HPA進行了系統命名。目前已有23個血小板同種抗原被正式命名[8]。在該抗原遺傳系統中，2個等位基因用a和b表示。分別代表基因頻率大于50%(a)和小于50% (b)。

本研究通過對100 名機采無償獻血者HPA-1～17系統研究，各系統均符合H-W遺傳平衡定律，說明檢測結果可靠。HPA- 2、HPA- 3 及HPA-15 是雜合度較高的3 個系統，與國內大部分報道一致[9-10]。HPA- 3的抗原位于糖蛋白GPⅡb上，其多態性是因為編碼位點上的一對堿基G-T被置換，分別為HPA- 3b和HPA- 3a。本研究對象HPA3a基因頻率為0.49，與中國2 458名漢族人群(3a基因頻率為0.558 6)[9]比較差異無統計學意義(χ2=0.393，P=0.531)。HPA系統中a、b不配合概率反映HPA在血小板輸注時刺激宿主的免疫系統產生血小板同種抗體概率。不同血小板抗體在導致同種免疫血小板減少癥中出現的概率也就不同。本研究對象中HPA- 3系統中b基因頻率大于50%，不配合率最高(0.420)，HPA-15系統次之，與趙毓宏[11]報道的浙江地區人群不完全一致，其原因可能為本研究對象僅局限于機采血小板固定獻血者或者兩者存在地域差異。陳鑫蘋[10]曾報道海南地區黎族機采血小板獻血者HPA- 3b(0.511)、HPA- 15b(0.575)的基因頻率偏高。本研究結果顯示HPA- 15b基因頻率顯著低于黎族機采血小板獻血者，HPA- 3b基因頻率無顯著差異。上述差異提示發生血小板輸注無效時，應注意HPA- 3、15基因系統的配合性輸注，尤其是aa、bb純合子的受血者。其它系統不配合率很低或等于 0，血小板免疫性反應的危險亦低。目前國內部分血站開始建立一定規模的單采血小板獻血者HPA 基因數據庫[12]，聯合大型醫院建立有效的輸血策略實現供患者間HPA 基因型特異性配合[13]，尤其是對已產生血小板特異性抗體的多次獻血者，取得良好的輸注效果[14]。隨著人們對血小板血型研究的逐步深入、PCR技術逐漸成熟以及DNA 序列的研究逐步明晰，大規模的HPA自動化基因分型技術和第五代芯片技術即將成為常規分型方法。各級血站建立和完善已知HPA基因型的血小板供者庫，對于需多次輸血的血液病患者輸注血小板從第 1 次開始就選擇ABO 血型相合，HPA交叉配型亦相合的單一供者的血小板輸注[15]，為有效解決血小板輸注無效提供有利的平臺。本研究中100例機采血小板固定獻血者獻者均可應患者需求隨時待命、即招即采，基本滿足本地區機采血小板臨床需求。充分利用本地區機采血小板供血者庫信息,為患者減少血小板輸注無效難題將是本課題下一步的研究的重點。