散血明目片防控增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的機制研究

劉曉清 譚涵宇 彭俊 秦惠鈺 田野 陳梅 吳權(quán)龍 彭清華

〔摘要〕 目的 觀察散血明目片對兔外傷性增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy， PVR）模型中增殖信號通路相關蛋白PI3K、Akt、P38MAPK、MEK表達的影響，探討散血明目片對兔外傷性PVR的防治作用。方法 實驗以42只新西蘭大白兔為對象，采用鞏膜穿通法聯(lián)合向玻璃體腔注射富含血小板血漿形成PVR模型，隨機分為7組，每組6只，分別為：A組空白組、B組模型組、C組散血明目片組、D組PD98059組、E組LY294002組、F組MK-2206組、G組抑制劑混合組。造模后30 min，D組、E組、F組、G組分別向玻璃體腔注射0.1 mL的PD98059、LY294002、MK-2206及3種混合抑制劑。B、C組則予以玻璃體腔內(nèi)注射0.1 mL生理鹽水。術后第1天C組予以散血明目片10 mg/kg溶液灌胃，除A組外其余組以生理鹽水10 mL/kg灌胃，連續(xù)灌胃28 d。28 d后采用B超觀察術眼玻璃體、眼底情況;取材后采用免疫組化法、RT-qPCR法對送檢組織進行相關蛋白表達的測定。結(jié)果 B超結(jié)果顯示散血明目片能抑制兔PVR中視網(wǎng)膜的增殖，維持視網(wǎng)膜正常形態(tài)。免疫組化與RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，散血明目片能有效降低兔視網(wǎng)膜及增殖膜中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK的表達，其中以下調(diào)PI3K、Akt、P38MAPK的表達更顯著。結(jié)論 散血明目片可抑制PVR的發(fā)生與發(fā)展，降低視網(wǎng)膜及增殖膜中相關增殖蛋白的表達，其防治PVR方面可能與MAPK、PI3K/Akt信號通路有關。

〔關鍵詞〕 增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變;散血明目片;絲裂原活化蛋白激酶;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B

〔中圖分類號〕R276.7 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.07.001

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Sanxue Mingmu Tablets on the expression of proliferation signal pathway related proteins PI3K， AKT， P38MAPK and MEK in a traumatic proliferative vitreoretinopathy （PVR） model of rabbits， and to explore the effects of Sanxue Mingmu Tablets in preventing and treating proliferative vitreoretinopathy. Methods For the experiment， 42 New Zealand white rabbits were used as subjects， and the scleral penetration method was combined with the injection of platelet-rich plasma into the vitreous cavity to establish a PVR model. They were randomly divided into 7 groups， with 6 rabbits in each group. They were group A： blank group; group B： model group; group C： Sanxue Mingmu Tablets group; group D： PD98059 group; group E： LY294002 group; group F： MK-2206 group; group G： inhibitor mixed group. In 30 minutes after modeling， 0.1 mL of PD98059， LY294002， MK-2206 and 3 kinds of mixed inhibitors were injected into the vitreous cavity to group D， group E， group F and group G， respectively. In group B and C， 0.1 mL of normal saline was injected into the vitreous cavity. On the first day after operation， the group C was administered with 10 mg/kg solution of Sanxue Mingmu Tablets by gavage. The other groups were intragastrically administered with 10 mL/kg normal saline for 28 days. After 28 days， the vitreous and fundus conditions were observed with B-ultrasound; After the samples were taken， immunohistochemistry and RT-qPCR were used to determine the protein expression of the submitted tissues. Results B-ultrasound showed that Sanxue Mingmu Tablets could inhibit the retina proliferation in rabbit PVR and maintain normal retinal shape. Immunohistochemistry and RT-qPCR showed that Sanxue Mingmu Tablets could effectively reduce the expression of PI3K， AKT， MEK， P38MAPK in the retina and proliferating membrane of rabbits， but the down-regulation of PI3K， Akt， P38MAPK was more significant. Conclusion Sanxue Mingmu Tablets can inhibit the occurrence and development of PVR and reduce the expression of related proliferative proteins in the retina and proliferating membrane. The prevention and treatment of PVR may be related to the MAPK and PI3K/Akt signaling pathways.

〔Keywords〕 ?proliferative vitreoretinopathy; Sanxue Mingmu Tablets; MAPK; PI3K/Akt

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy， PVR）多由眼外傷、大面積視網(wǎng)膜脫離、較大裂孔、玻璃體積血等引起視網(wǎng)膜缺血、炎癥、細胞增殖，造成玻璃體腔、視網(wǎng)膜前、下及表面形成纖維增生膜并易形成收縮，造成局部牽拉為特征的眼科疾病。PVR為多種玻璃體視網(wǎng)膜疾病的病理基礎和表現(xiàn)，具有病程長、易復發(fā)性。一旦形成，治療上頗為棘手，往往需要多次手術且術后視力恢復較差，嚴重易成盲[1]。

中醫(yī)藥防治PVR具有一定的潛力，根據(jù)疾病特點可歸屬于“暴盲”“視瞻昏渺”范疇。由于外力損傷或氣機阻滯或痰濕上犯所致，導致氣血運行不通，形成瘀血、痰飲于眼內(nèi)，日久成膜黏附于視衣及神膏之內(nèi)，堅固難移，所謂“癥積”。散血明目片具有活血利水、散結(jié)明目功效，是用于防治玻璃體積血以及PVR的中醫(yī)藥復方。前期基礎實驗研究表明散血明目片能夠有效維持視網(wǎng)膜正常形態(tài)，并有效減少炎癥細胞、炎癥細胞因子的表達，抑制增生組織及新生血管的形成[2-5]。

國內(nèi)外實驗研究表明絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases， ?PI3K）/蛋白激酶B（protein-serine-threonine kinase， Akt）信號通路在PVR發(fā)生過程中有效被激活，參與了相關細胞的增殖、遷移與凋亡。本實驗以外傷性PVR兔模型為研究對象，進一步探討散血明目片對PVR中MAPK、PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)機制。

1 材料

1.1 ?實驗動物

新西蘭大白兔44只（湖南太平生物科技有限公司，合格證號：43608300000675），體質(zhì)量1 500～2 000 g，雌雄各半，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心。所有實驗動物行常規(guī)檢查，排除全身疾患，均適應性飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)實驗室溫度維持在18～26 ℃，濕度在55%左右，每日常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.2 ?藥物

散血明目片：由三七、酒大黃、澤瀉、豬苓等藥組成，規(guī)格為0.3 g/片，100片/瓶。購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，藥物為同一批次（20171228）。實驗員在規(guī)范無菌操作下對藥片碾碎至粉末狀，并密封至干燥藥罐內(nèi)，存于實驗房消毒柜中。妥布霉素滴眼液（批號：18J02CA，比利時s.a.ALCON-COUVRUR）、典必殊眼膏（批號：9GBH1A，比利時s.a.ALCON-COUVRUR）、美多麗滴眼藥（批號：MP2080，參天制藥株式會社）、杰奇凝膠（批號：20180212，湖北遠大天天明制藥有限公司）、生理鹽水（批號：B18020302d，湖南康源制藥有限公司）等，均購自湖南中醫(yī)藥大第一附屬醫(yī)院，所購藥物為同一批次;均放于實驗動物中心消毒柜中保存。

1.3 ?試劑

LY294002（貨號：S1105，品牌：Selleck， PI3K蛋白抑制劑）、PD98059（貨號：S1177，品牌：Selleck，MEK蛋白抑制劑）、MK-2206抑制劑（貨號：S1078，品牌：Selleck，Akt抑制劑），RIPA蛋白裂解液（CWBIO，CW2334S），ECL發(fā)光檢測試劑盒（貨號：35055，品牌：Thermo Fisher），HRP標記的羊抗鼠二抗（貨號：SA00001-1，品牌：PROTEINTECH）HRP標記的羊抗兔二抗（貨號：SA00001-2，品牌：PROTEINTECH），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：A3500，品牌：Promega）等。

1.4 ?器材

精密分析天平（瑞士Mettler公司，AE240）;顯微手術器械（由湖南中醫(yī)藥大學五官科實驗室提供）;眼部B超機（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院眼科提供）;超微量分光光度計（德國IMPLEN公司）;生物組織攤片機（金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（由湖南中醫(yī)藥大學組織與胚胎實驗室提供）;KD-BMⅡ電腦生物組織包埋機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）。

2 方法

2.1 ?動物分組

采用隨機分組法將其中42只新西蘭兔。分為7組，每組6只（雌雄各半），A組：空白組（正常組）;B組：模型組;C組：散血明目片組;D組：PD98059組;E組：LY294002組;F組：MK-2206組;G組：抑制劑混合組。

2.2 ?富含血小板血漿制備

余2只新西蘭大白兔，25%烏拉坦進行腹腔注射，劑量4 mL/kg。麻醉滿意后，剔除腹部兔毛，常規(guī)消毒鋪巾，切開腹部皮膚約10 cm左右，分離筋膜及肌肉，充分暴露腹腔。鈍性分離兔腹主動脈后，用采血針頭刺入主動脈另一頭連接真空采血管。共抽取腹主動脈血50 mL，用TDZ4-WS臺式低速離心機1 500 r/min離心5 min，吸出上層血清后中間即為富含血小板血漿（platelet-richplasma， PRP），收集后置于無菌恒溫搖擺箱備用[6]。

2.3 ?模型建立及給藥

參考實驗與文獻方法[6]，本次所有實驗兔均采取右眼為實驗眼，充分散瞳全麻后，進行常規(guī)消毒鋪巾。開瞼器充分暴露眼球，進行眼部局麻。從3點至9點方向分離球結(jié)膜和筋膜，用鞏膜穿刺刀在角膜緣后3 mm處刺向玻璃體中心部，操作時勿刺傷屈光間質(zhì)和視網(wǎng)膜，用顯微鞏膜剪將切口至兩側(cè)擴大，傷口達6 mm。輕壓兔眼球，將脫出的玻璃體剪除，用8-0可吸收縫合線縫合切口后向玻璃體腔中央注入0.1 mL的PRP。造模后30 min，D-G組分別予以玻璃腔注射0.1 mL的PD98059、LY294002、MK-2206及3種混合抑制劑;B、C組則予以玻璃體腔內(nèi)注射0.1 mL 0.9%Nacl溶液。術后予以妥布霉素眼膏涂于結(jié)膜囊內(nèi)。造模后1周內(nèi)，予以妥布霉素滴眼液滴眼，3次/d，復方托吡卡胺滴眼液滴右眼，3次/d。術后第1天開始，C組予以散血明目片10 mg/kg溶液灌胃，其余組除A組外以生理鹽水10 mL/kg灌胃，均灌胃4周。

2.4 ?指標檢測

2.4.1 ?眼部B超檢查 ?造模用藥后第28天進行術眼的B超檢查，觀察玻璃體及眼底情況。

2.4.2 ?免疫組化法檢測視網(wǎng)膜及增殖膜中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK蛋白表達情況 ?將眼球標本固定、切片、脫蠟、水化后，按照SP法免疫組化檢測系統(tǒng)進行操作。在玻片上作分組標記，防置高倍鏡下觀察視網(wǎng)膜增殖膜組織中蛋白PI3K、MEK、Akt的表達情況，并隨機選取視野，用圖像分析儀進行分析統(tǒng)計。

2.4.3 ?RT-qPCR法檢測各組視網(wǎng)膜及增殖膜中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK mRNA的表達 ?從標本中提取RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，qPCR引物進行real-time PCR，檢測組織中目的基因和內(nèi)參基因的表達、超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度、第一鏈cDNA合成、RT-qPCR檢測最后進行數(shù)據(jù)分析。用于PCR實驗的引物序列見表1。

2.5 ?統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0系統(tǒng)軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果所有數(shù)據(jù)以“x±s”表示。多組比較，若滿足正態(tài)性和方差齊性，采用方差分析，不滿足則采用秩和檢驗。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ?造模并用藥28 d后各組眼部B超結(jié)果

A組：兔眼球?qū)ΨQ，大小正常;晶狀體顯示清晰，大小位置正常，回聲好;球壁光滑，回聲均勻。所有造模組中眼球大小正常，晶狀體無異常，球壁回聲均欠均勻，玻璃體腔內(nèi)與視網(wǎng)膜組織中均可見不同程度的增殖跡象。B組：玻璃體腔內(nèi)可見高回聲光帶與視網(wǎng)膜廣泛粘連，光帶厚度不均。C組：玻璃體腔內(nèi)有細小線狀回聲。D組：玻璃體腔內(nèi)小片膜狀與視網(wǎng)膜部分粘連。E組：玻璃體腔內(nèi)有大片狀膜狀回聲，部分與視網(wǎng)膜粘連。F組：玻璃體腔內(nèi)靠近視網(wǎng)膜可見小片狀高回聲膜狀物與視網(wǎng)膜粘連。G組：玻璃體腔稍見點狀高回聲，視網(wǎng)膜表面見細小膜狀回聲光帶。見圖1。

3.2 ?免疫組化法檢測各組視網(wǎng)膜及增殖膜組織中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK表達情況

與A組比較，B-G組各蛋白表達量均升高（P<0.05或P<0.01）。與B組比較，C-G組各蛋白表達量，除Akt蛋白表達中D組與B組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），余均有意義（P<0.05或P<0.01）。與C組比較，在PI3K蛋白表達上：D-F組表達量均高于C組（P<0.05或P<0.01），G組表達量與C組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;Akt蛋白表達上：D、E組表達量均高于C組（P<0.01），F(xiàn)、G組表達量接近C組，比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;MEK蛋白表達上：E、F組表達量均高于C組（P<0.01），D、G組表達量均低于C組（P<0.05）;P38MAPK蛋白表達上：D-G組表達量與C組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。見圖2-5和表2。

3.3 ?RT-qPCR檢測各組視網(wǎng)膜及增殖膜中PI3K、Akt、MEK、P38MAPK mRNA的表達情況

造模后，各蛋白均在組織中呈現(xiàn)不同程度的表達：與A組比較，B-G組各蛋白表達量均升高（P<0.05或P<0.01），其中PI3K和Akt蛋白表達中G組與A組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與B組比較，C-G組各蛋白表達量均降低（P<0.05或P<0.01）。與C組比較，PI3K蛋白表達中：D-F組表達量均高于C組（P<0.05或P<0.01），G組與C組表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;Akt蛋白表達中：D-F組表達量均高于C組（P<0.01），G組與C組表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;MEK蛋白表達中：D、G組表達量均低于C組（P<0.05），E、F組表達量高于C組（P<0.01）;P38MAPK蛋白表達中：D-G組表達量均高于C組（P<0.05或P<0.01）。見表3。

4 討論

目前，PVR的臨床治療主要以手術為主，但術后復發(fā)率高以及視力的提升率低成為了治療瓶頸。研究顯示從最初的癥狀到增殖膜形成造成視網(wǎng)膜脫離的時間需要1～2月，因此，開發(fā)有效的新藥阻止和治療PVR前期藥物的工作緊迫[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PVR是細胞高增殖與低凋亡的病理過程，抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡成為攻破該疾病的一大入口[7]。MAPK作為信號傳導酶在多種細胞功能中起著關鍵作用，包括誘導細胞增殖、趨化因子表達和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。而P38MAPK則是其中的關鍵部分，與PVR的發(fā)生關系密切，調(diào)控了細胞的增殖與遷移[8-10]。Saika等[11]利用P38MAPK抑制劑和dominant negative（DN）p38MAPK研究了TGF-p38MAPK通路對RPE細胞的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果也表明TGF-p38MAPK通路與RPE細胞遷移密切相關，證明MAPK通路參與了EGF刺激下的RPE細胞遷移和增生。MAPK通路有三級的信號傳遞過程：MAPK、MAPK激酶（MEK或MKK）以及MAPK激酶的激酶（MEKK或MKKK）。最具特征的MAPK信號通路是RAS-RAF-MEK-ERK信號通路，受體酪氨酸激酶、G蛋白偶聯(lián)的受體和部分細胞因子受體均可激活該信號通路，但外界刺激RAS被激活是信號聯(lián)級的第一步，RAS介導激活RAF后會反過來激活雙功能激酶MEK，可以使絲/蘇氨酸和酪氨酸發(fā)生磷酸化，最終高度選擇性地激活ERK1和ERK2[12]。國外學者研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶激活PAR-1可通過RAS激活RAF-MEK-ERK1/2信號通路而誘導RPE細胞的增殖[13]。

PI3K是由P85調(diào)節(jié)亞基與P110催化亞基組成，在細胞存活途徑、基因表達和細胞代謝調(diào)控、細胞骨架重排等方面發(fā)揮了重要作用。而Akt則是PI3K信號產(chǎn)生的重要靶點，Akt磷酸化多個參與細胞周期控制的蛋白質(zhì)，最終刺激細胞的生長[14]。CAI N等[15]通過收集PVR患者視網(wǎng)膜進行檢測，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號通路在PVR視網(wǎng)膜色素上皮中高度激活。通過信號通路抑制劑RAPA和LY294002可通過降低mTOR信號元件的磷酸化水平而抑制細胞增殖、細胞周期的進程并促進了細胞的凋亡，從而阻滯了PVR的發(fā)展。陳海婷等發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過P38MAPK和PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導RPE細胞周期阻滯和凋亡，對PVR的防控起到了一定的作用[16]。

散血明目片是在中醫(yī)眼科活血利水法理論指導下的治療PVR臨床經(jīng)驗方，由三七、酒大黃、蒲黃、益母草、防己、地龍、白茅根、豬苓、澤瀉、山楂等中藥組成。縱觀全方，以功效為止血化瘀的三七和蒲黃為君藥，使眼部血癥得以控制以及消散停于神膏內(nèi)、視衣上的“瘀血”，兩藥均歸屬肝經(jīng)。以利水滲濕藥豬苓與澤瀉為臣藥，利水滲濕而化濁，將眼珠內(nèi)“痰飲”及時排出，兩藥歸屬腎、膀胱經(jīng)。方中酒大黃，上清上焦血分熱毒，以消雙目之血瘀水結(jié)之癥;蒲黃，性甘、平，止血化瘀，利水通淋;益母草，活血清熱，利水消腫，均為佐藥，歸屬肝經(jīng)。白茅根、地龍、防己性寒，涼血止血而利尿，均歸屬肺、膀胱經(jīng)，亦為佐藥。山楂性溫，行氣散瘀而化濁為使藥，歸脾、胃、肝經(jīng)，調(diào)和寒性藥物而不傷胃，加強行氣散瘀之功。全方共奏活血通脈、利水散結(jié)之功，使瘀血去、痰飲消，行氣通脈而使雙目明。

在本次實驗研究中，B超結(jié)果顯示造模后28 d各造模組在視網(wǎng)膜及玻璃體出現(xiàn)不同程度的增殖，在散血明目片組中未見有大片的膜狀高回聲，有效地抑制了增殖膜的形成，從而避免引起局部收縮形成瘢痕褶皺造成視網(wǎng)膜脫離的嚴重并發(fā)癥。免疫組化法檢測視網(wǎng)膜組織PI3K、Akt、MEK、P38MAPK蛋白表達中，各蛋白表達量均有所下降，以及蛋白表達多在視神經(jīng)纖維層以及節(jié)細胞層。RT-qPCR檢測增殖膜上各蛋白表達情況顯示：散血明目片均可減少PI3K、Akt、MEK、P38MAPK蛋白在增殖膜上的表達，其中以下調(diào)PI3K、Akt、P38MAPK蛋白顯著，對MEK蛋白調(diào)控不顯著。

本研究提示MAPK及PI3K/Akt信號通路至少部分參與了兔PVR生成的可能性，可能進一步揭示散血明目片防控PVR的機制，并為臨床治療提供新的靶點。

參考文獻

[1] CHARTERIS D G. Proliferative vitreoretinopathy： Revised concepts of pathogenesis and adjunctive treatment[J]. Eye， 2020， 34（2）： 241-245.

[2] 陳 ?吉，彭清華，邢雁飛，等.活血利水法對外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變兔眼玻璃體TGF-β1表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2010，30（5）：12-15.

[3] 邢雁飛，彭清華，付美林，等.活血利水法對外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變模型兔眼IGF-1表達的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊，2010， 28（4）：782-785.

[4] 彭清華，魏 ?為，李建超.活血利水法對外傷性實驗性PVR模型兔眼玻璃體中生長因子濃度影響的研究[J].湖南中醫(yī)學院學報， 2004，24（6）：34-37.

[5] 付美林，彭清華，陳 ?吉，等.活血利水法對兔外傷性PVR增殖膜上EGFmRNA表達的影響[J].國際眼科雜志，2012，12（1）：25-29.

[6] 姜彩輝，張卯年.實驗性外傷增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變動物模型的改進[J].眼科研究，2003，21（6）：579-581.

[7] 余 ?豐，張來林，潘金花，等.增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制研究概況[J].中醫(yī)眼耳鼻喉雜志，2018（2）：114-117.

[8] SUI X B， KONG N， YE L， et al. P38 and JNK MAPK pathways control the balance of apoptosis and autophagy in response to chemotherapeutic agents[J]. Cancer Letters， 2014， 344（2）： 174-179.

[9] 劉曉清，譚涵宇，項 ?宇，等.絲裂原活蛋白激酶信號通路與增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變相關性的研究進展[J].中國中醫(yī)眼科雜志， 2019，29（5）：416-419.

[10] LIN C C， SHYR M H， CHIEN C S， et al. Thrombin-stimulated cell proliferation mediated through activation of Ras/Raf/MEK/MAPK pathway in canine cultured tracheal smooth muscle cells[J]. Cellular Signalling， 2002， 14（3）： 265-275.

[11] SAIKA S， YAMANAKA O， IKEDA K， et al. Inhibition of p38MAP kinase suppress fibrotic reaction of retinalpigmentepithelialcells. Laboratory nvestigation[J]. Laboratory Investigation： Advancing the understanding of human and experimental disease， 2005，85（7）：838-850.

[12] ROUX P P， BLENIS J. ERK and p38 MAPK-activated protein kinases： A family of protein kinases with diverse biological functions[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2004， 68（2）： 320-344.

[13] PALMA-NICOLAS J P， L？魷PEZ E， L？魷PEZ-COLOM？魪 A M. PKC isoenzymes differentially modulate the effect of thrombin on MAPK-dependent RPE proliferation[J]. Bioscience Reports， 2008， 28（6）： 307-317.

[14] LEWIS C CANTLEY. The Phosphoinsitide 3-kinase Pathyway[J].Scinece， 2002， 296（5573）： 1655-1657.

[15] CAI N， DAI S D， LIU N N， et al. PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitors in proliferation of retinal pigment epithelial cells[J]. International Journal of Ophthalmology， 2012， 5（6）： 675-680.

[16] CHEN H T， WANG H F， AN J B， et al. Plumbagin induces RPE cell cycle arrest and apoptosis via p38 MARK and PI3K/Akt/mTOR signaling pathways in PVR[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine， 2018， 18（1）： 1-10.